Caractérisation de la fonction de la protéine d'échafaudage CNK pendant la fermeture du thorax chez la drosophile
Thèse ou mémoire / Thesis or Dissertation
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Doctorat / Doctoral
Programme
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Mots-clés
- Fermeture des tissus
- protéine d'échafaudage
- Thorax Closure
- Scaffold protein
- CNK
- cell signalling
- epithelial integrity
- CNK
- Drosophila melanogaster
- signalisation cellulaire
- miniTurboID
- migration
- intégrité épithéliale
- Fermeture du thorax
- Tissue closure
Organisme subventionnaire
Résumé
Résumé
Les cellules perçoivent des informations provenant de leur environnement et les intègrent pour produire une réponse cellulaire appropriée. La transformation du signal extracellulaire en réponse s’effectue par la collaboration d’un ensemble de protéines organisé en « voie de signalisation ». Ces voies ne fonctionnent pas de manière isolée les unes des autres, mais partagent différentes molécules de signalisation. Afin de générer une réponse spécifique, la cellule doit finement réguler ces voies de signalisation dans le temps et l’espace. Les protéines d’échafaudage jouent un rôle essentiel dans cette régulation en agissant comme des organisateurs spatiotemporels des molécules de signalisation. Les protéines Connector eNhancer of KSR (CNK), conservées au cours de l'évolution, font partie de cette classe de protéines. Initialement identifiée chez Drosophila melanogaster, la protéine CNK agit comme un régulateur positif de la voie RAS-ERK. Chez les mammifères, ces protéines participent à diverses voies de signalisation impliquant des petites GTPases. Il a récemment été rapporté que la protéine CNK2A humaine promeut la migration des cellules cancéreuses dans un modèle de cicatrisation de plaie in vitro. L’objectif de notre étude est d’explorer si la capacité à promouvoir la migration de CNK est conservée chez la drosophile en utilisant un modèle de cicatrisation in vivo : la fermeture du thorax. Lors de cet événement, les épithéliums dorsaux des deux disques imaginaux de l'aile, appelés héminota (HEs), migrent sur un épiderme larvaire (LEC) et fusionnent au niveau de la ligne médiane pour former un épithélium continu. Dans un premier temps, nous avons montré que la déplétion de la protéine d’échafaudage CNK induit une fente à la ligne médiane des thorax des mouches adultes. Des observations en temps réel révèlent que CNK contrôle la migration et la fusion des HEs, ainsi que l’intégrité du LEC. Des expériences de surexpression montrent que la partie C-terminale de CNK (CNK-CT) agit comme un dominant négatif lors de cet événement. De façon intéressante, cet effet ne dépend pas de sa liaison à la kinase RAF, mais de sa liaison à la membrane plasmique et de son interaction à la kinase non-réceptrice Src42A. Nous avons également identifié la région minimale de CNK-CT agissant comme un dominant négatif. Ces résultats font l’objet d’un manuscrit en préparation. Dans un second temps, nous avons entrepris d’identifier le mécanisme d’action de la protéine CNK lors de la fermeture du thorax. Nous avons examiné l’implication de CNK dans la régulation de la cascade JNK, une voie primordiale pour cet événement. En parallèle, nous avons montré que CNK interagissait avec la kinase de la famille Ste20 Misshapen (MSN) et que cette interaction semble requise pour la fermeture du thorax. Par la suite, nos expériences de miniTurboID suggèrent que CNK est à proximité de protéines impliquées dans le trafic vésiculaire, la migration cellulaire, la transduction du signal et la régulation de la voie Hippo. L’implication de ces interacteurs dans la fermeture du thorax est en cours d’investigation. Cependant, nous avons mis en lumière l’implication d’une nouvelle voie dans la fermeture du thorax : la voie Hippo. Ainsi, ces travaux de recherche suggèrent que la capacité promigratoire de CNK est conservée chez la drosophile et que CNK contrôle le processus de fermeture épithéliale lors de la fermeture du thorax. Des travaux supplémentaires affineront la compréhension des mécanismes moléculaires qui régissent cet événement. Notre travail participe potentiellement à l’élaboration de nouvelles stratégies thérapeutiques dans des maladies liées à un défaut de fermeture épithéliale, comme des défauts de formation du tube neural ou la cicatrisation.
Cells sense information from their environment and integrate it to produce an appropriate cellular response. The processing of the extracellular signal into a response is achieved through the collaboration of a set of proteins organized into “signalling pathways.” These pathways do not function in an isolated manner but share different signalling molecules. To generate a specific response, the cell must finely regulate these signalling pathways in time and space. Scaffolding proteins play an essential role in this regulation, acting as spatiotemporal organizers of signalling molecules. The evolutionarily conserved Connector eNhancer of KSR (CNK) proteins belong to this class of proteins. First identified in Drosophila melanogaster, the CNK protein acts as a positive regulator of the RAS-ERK pathway. In mammals, these proteins participate in various signalling pathways involving small GTPases. It was recently reported that human CNK2A promotes cancer cell migration in an in vitro wound healing assay. The aim of our study is to explore whether the ability of CNK to promote migration is conserved in Drosophila using an in vivo wound healing assay: Thorax closure (TC). During this event, the dorsal epithelium of the two wing imaginal discs, called heminota (HEs), migrate over a larval epidermis (LEC) and fuse at the midline to form a continuous epithelium. First, we showed that depletion of the CNK scaffolding protein induces a midline cleft in adult flies’ thoraces. Real-time observations reveal that CNK controls HE migration and fusion, as well as LEC integrity. Overexpression experiments show that the C-terminal part of CNK (CNK-CT) acts as a dominant negative in this event. Interestingly, this effect does not depend on its binding to the RAF kinase, but on its binding to the plasma membrane and interaction with the non-receptor kinase Src42A. We also identified the minimal region of CNK-CT acting as a dominant negative. These results are the subject of a manuscript in preparation. Secondly, we set out to identify the mechanism of action of the CNK protein during TC. We investigated the involvement of CNK in the regulation of the JNK cascade, a key pathway for TC. In parallel, we showed that CNK interacts with the Ste20 family kinase Misshapen (MSN) and that this interaction appears to be required for TC. Subsequently, our miniTurboID experiments suggest that CNK is in close proximity to proteins involved in vesicular trafficking, cell migration, signal transduction and regulation of the Hippo pathway. The involvement of these interactors in TC is under investigation. However, we have highlighted the involvement of a new pathway in TC: the Hippo pathway. This research suggests that the pro-migratory capacity of CNK is conserved in Drosophila, and that CNK controls the epithelial closure process during TC. Further work will refine our understanding of the molecular mechanisms governing this event. Our work has the potential to contribute to the development of new therapeutic strategies for diseases associated with defective epithelial closure, such as defects in neural tube formation or wound healing.
Cells sense information from their environment and integrate it to produce an appropriate cellular response. The processing of the extracellular signal into a response is achieved through the collaboration of a set of proteins organized into “signalling pathways.” These pathways do not function in an isolated manner but share different signalling molecules. To generate a specific response, the cell must finely regulate these signalling pathways in time and space. Scaffolding proteins play an essential role in this regulation, acting as spatiotemporal organizers of signalling molecules. The evolutionarily conserved Connector eNhancer of KSR (CNK) proteins belong to this class of proteins. First identified in Drosophila melanogaster, the CNK protein acts as a positive regulator of the RAS-ERK pathway. In mammals, these proteins participate in various signalling pathways involving small GTPases. It was recently reported that human CNK2A promotes cancer cell migration in an in vitro wound healing assay. The aim of our study is to explore whether the ability of CNK to promote migration is conserved in Drosophila using an in vivo wound healing assay: Thorax closure (TC). During this event, the dorsal epithelium of the two wing imaginal discs, called heminota (HEs), migrate over a larval epidermis (LEC) and fuse at the midline to form a continuous epithelium. First, we showed that depletion of the CNK scaffolding protein induces a midline cleft in adult flies’ thoraces. Real-time observations reveal that CNK controls HE migration and fusion, as well as LEC integrity. Overexpression experiments show that the C-terminal part of CNK (CNK-CT) acts as a dominant negative in this event. Interestingly, this effect does not depend on its binding to the RAF kinase, but on its binding to the plasma membrane and interaction with the non-receptor kinase Src42A. We also identified the minimal region of CNK-CT acting as a dominant negative. These results are the subject of a manuscript in preparation. Secondly, we set out to identify the mechanism of action of the CNK protein during TC. We investigated the involvement of CNK in the regulation of the JNK cascade, a key pathway for TC. In parallel, we showed that CNK interacts with the Ste20 family kinase Misshapen (MSN) and that this interaction appears to be required for TC. Subsequently, our miniTurboID experiments suggest that CNK is in close proximity to proteins involved in vesicular trafficking, cell migration, signal transduction and regulation of the Hippo pathway. The involvement of these interactors in TC is under investigation. However, we have highlighted the involvement of a new pathway in TC: the Hippo pathway. This research suggests that the pro-migratory capacity of CNK is conserved in Drosophila, and that CNK controls the epithelial closure process during TC. Further work will refine our understanding of the molecular mechanisms governing this event. Our work has the potential to contribute to the development of new therapeutic strategies for diseases associated with defective epithelial closure, such as defects in neural tube formation or wound healing.
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