Évaluation de la capacité immunoprotectrice de protéines recombinantes exposées à la surface de Clostridium perfringens pour le développement d'un vaccin efficace contre l'entérite nécrotique aviaire

Abstract

Certaines souches pathogènes de Clostridium perfringens de type G provoquent l’entérite nécrotique aviaire, une maladie gastro-intestinale complexe des poulets à chair qui a de graves conséquences économiques pour l'industrie avicole mondiale, et pour laquelle, une stratégie de contrôle efficace fait actuellement défaut. En utilisant une approche par vaccinologie inverse comparative et soustractive, notre équipe a identifié 14 cibles vaccinales uniques à six souches de Clostridium perfringens causant l’entérite nécrotique et absentes des dix souches commensales. Les objectifs de la présente thèse étaient (i) d’analyser le contenu génomique d'une collection de 41 souches de Clostridium perfringens; (ii) de valider des données antérieures obtenues in silico pertinent à l'identification de 14 cibles vaccinales, de générer des protéines recombinantes et d’évaluer leur immunogénicité; (iii) d’étudier les capacités protectrices des protéines recombinantes dans un modèle d’induction expérimentale de l’entérite nécrotique; et (iv) d’étudier le lien entre les réponses immunitaires et les profils du microbiote intestinal chez des poulets de chair vaccinés soumis à ce modèle d’induction de l’entérite nécrotique. Pour atteindre le premier objectif, la présence de 20 facteurs de virulence associés à Clostridium perfringens a été documentée. Trois loci importants d'entérite nécrotique (NELoc-1, 2 et 3) ont été caractérisés et l'existence de gènes de résistance aux antibiotiques, d'éléments de prophage et de plasmides a été évaluée. De plus, l'analyse pangénomique a été réalisée. Les résultats ont révélé une grande diversité génomique dans les isolats de Clostridium perfringens, avec seulement 6% des gènes représentant le génome coeur (chapitre 4). Le deuxième article (chapitre 5) présente les résultats relatifs au deuxième objectif. Les résultats ont montré que la moitié des séquences codant pour les protéines sont présentes dans le génome de souches commensales. Donc, ces séquences ont donc été exclues des étapes subséquentes. Cinq protéines ont alors été produites et utilisées pour l'immunisation des poulets de chair. Les résultats d’analyse par ELISA ont montré que les titres d'anticorps de type IgY à 21 et 35 jours d’âge chez les oiseaux vaccinés étaient significativement plus élevés que ceux mesurés aux jours 7 et 14, et plus élevés que ceux du groupe d'oiseaux recevant l'adjuvant seul (valeur-p ≤ 0,001). Finalement, les résultats ont montré que les anticorps produits chez les oiseaux immunisés à l’aide des candidats vaccinaux offraient une protection partielle contre l’entérite nécrotique, avec seulement 30% des 80 oiseaux vaccinés présentant des lésions typiques d'entérite nécrotique. Aussi, le séquençage des amplicons de la région V4 de l’ARN ribosomal 16S a montré que l'immunisation n’a pas modifié l'abondance relative des bactéries bénéfiques productrices de butyrate, y compris Ruminococcaceae, par rapport au groupe témoin (valeur-p > 0,05). En revanche, l'abondance relative des familles bactériennes considérées comme nocives, telles que les Enterobacteriaceae, a été réduite de manière significative (valeur-p < 0,01) chez certains groupes (chapitre 6). À notre connaissance, aucune étude n'a jusqu'à présent identifié et produit de protéines candidates vaccinales exposées à la surface et uniques à Clostridium perfringens causant l’entérite nécrotique en utilisant une approche par vaccinologie inverse comparative et soustractive. Pour une application de cette approche vaccinale dans l'industrie, d'autres méthodes de livraison, y compris l'immunisation in ovo, la vaccination orale ou même l'immunisation des poules reproductrices devraient être envisagées dans les études futures. Certain pathogenic strains of Type G Clostridium perfringens cause avian necrotic enteritis, a complex gastrointestinal disease of broilers that has serious economic consequences for the global poultry industry, and for which, an effective control strategy is currently lacking. Using a comparative and subtractive reverse vaccinology approach, our group identified 14 vaccine targets unique to six necrotic enteritis-causing strains of Clostridium perfringens and absent from ten commensal strains. The objectives of the present thesis were to (i) analyze the genome content of a collection of 41 Clostridium perfringens; (ii) validate previously obtained in silico results pertaining to the identification of 14 vaccine candidates, generate recombinant proteins, and evaluate their immunogenicity; (iii) study the protective capacity of the recombinant proteins in an experimental necrotic enteritis induction model; and (iv) study the link between immune responses raised and intestinal microbiota profiles in vaccinated broilers subjected to the experimental necrotic enteritis induction model. To accomplish the first objective, the presence of 20 Clostridium perfringens-associated virulence factors was documented. Three important necrotic enteritis loci (NELoc-1, 2 and 3) were also characterized and the existence of antibiotic-resistance genes, prophage elements, and plasmids was assessed. Furthermore, the pangenome analysis was performed. The results revealed a great genomic diversity in Clostridium perfringens isolates, with only 6% of genes representing the core genome (chapter 4). The second article (chapter 5) presents the findings related to the second objective. The results showed that half of the protein-encoding sequences are present in the genome of the commensal strains. These candidates were therefore excluded from subsequent steps. Five proteins have been produced and used for the immunization of broilers, subsequently. ELISA results showed that IgY antibody titers in the vaccinated birds at 21 and 35 days of age were significantly higher than those measured on days 7 and 14, and higher than those in the group of birds receiving the adjuvant alone (p-value ≤ 0.001). Finally, the results showed that the antibodies produced in birds immunized with vaccine candidates offered partial protection against necrotic enteritis, with only 30% of the 80 birds vaccinated showing typical necrotic enteritis lesions. Furthermore, sequencing of the 16S ribosomal RNA V4 region amplicons showed that immunization did not alter the relative abundance of beneficial butyrate-producing bacteria, such as Ruminococcaceae, compared to the control group (p-value > 0.05). In contrast, the relative abundance of families considered harmful such as Enterobacteriaceae was significantly reduced (p-value < 0.01) in certain groups (chapter 6). To our knowledge, no previous study has identified and produced surface-exposed vaccine candidate proteins unique to Clostridium perfringens causing necrotic enteritis using a comparative and subtractive reverse vaccinology approach. For application in industry, other delivery methods including in ovo immunization, oral vaccination, or immunization of breeder hens should be considered in future studies.