Rôle d’Ankyrin-repeat and SOCS-Box protein 9 (ASB9) dans l'inhibition de PAR1 et la voie de signalisation MAPK dans l'ovaire bovin

Abstract

Les protéines Ankyrin-repeat and SOCS-box (ASB), incluant ASB9, sont membres des ubiquitine ligases E3 et régulent la prolifération cellulaire, la différenciation, la carcinogenèse et le cycle cellulaire dans divers types de cellules, y compris les cellules de granulosa (GC). Nous avons précédemment identifié ASB9 comme un gène induit par l’ hormone lutéinisante et la gonadotrophine chorionique humaine (LH/hCG) dans les GC des follicules ovulatoires bovins. Nos résultats antérieurs ont également permis d’identifier des protéines partenaires cibles d’ASB9 dans les GC dont protease-activated receptor 1 (PAR1). Cependant, les rôles exacts d'ASB9 dans l'activité des GC et son impact sur diverses voies de signalisation doivent être pleinement étudiés. Dans ce projet, nous avions pour objectif d'étudier les mécanismes d'action d'ASB9 dans les GC et de déterminer si l'induction d'ASB9 par la LH/hCG est nécessaire pour la régulation de gènes cibles tels que PAR1 et des voies de signalisation impliquées dans la fonction et l'activité des GC. Des GC en culture ont été traitées avec différentes doses de FSH, LH et thrombine. Les analyses RT- qPCR ont montré que la thrombine augmentait l'expression de PAR1 dans les GC (P<0.05) alors que la FSH n'avait aucun effet sur PAR1. Le traitement avec la LH a réduit de manière significative PAR1 (P<0.05), même en présence de thrombine, démontrant une régulation négative de PAR1 par la LH, possiblement via une induction concomitante d'ASB9 par la LH. Les résultats de Western blot montrent que l'expression d'ASB9 dans les GC in vitro est augmentée 12 heures après le traitement avec LH (P<0.05). De plus, le profil de phosphorylation de MAPK3/1 (ERK1/2) dans les GC traitées avec la thrombine suggère un contrôle médié par PAR1, tandis que la présence d'ASB9 dans les GC semble avoir un effet négatif sur la voie MAPK. Enfin, la thrombine pourrait bloquer très tôt (dans 1 heure de traitement) l'effet négatif d'ASB9 sur PAR1 alors que cette protéase ne semble pas affecter l'effet d’ASB9 à 6 et 12 heures de traitement. Les tests de prolifération ont montré qu'ASB9 régulait négativement le nombre des GC ainsi que le marqueur de prolifération CCND2, tandis que le marqueur d'apoptose BAX2 était augmenté avec le traitement avec la LH. Ensemble, ces données démontrent le mode d'action et les effets fonctionnels d'ASB9 sur la régulation de PAR1 avec des conséquences sur la prolifération, la différenciation et l'activité stéroïdogène des GC, suggérant un rôle crucial d’ASB9 dans le processus ovulatoire chez l'espèce bovine. The Ankyrin-repeat and SOCS-box protein (ASB) family, including ASB9, is part of the E3 ubiquitin ligases and regulates cell proliferation, differentiation, carcinogenesis, and cell cycle in various cell types including granulosa cells (GC). We previously identified ASB9 as an LH/hCG-induced gene in GC of bovine ovulatory follicles. We also reported ASB9 target binding partners in GC such as protease-activated receptor 1 (PAR1). However, the exact roles of ASB9 in GC activity and its impact in various signaling pathways need to be fully investigated. In this project, we aimed to study the mechanisms of action of ASB9 in GC and determine whether ASB9 induction by LH/hCG is necessary for the regulation of target genes such as PAR1, and signaling pathways involved in GC function and activity. Cultured GC were treated with different doses of FSH, LH and Thrombin. RT-qPCR analyzes showed that thrombin increased PAR1 expression in GC (P<0.05) while FSH had no effect on PAR1. Treatment with LH reduced significantly PAR1 (P<0.05), even in the presence of thrombin, demonstrating downregulation of PAR1 by LH, possibly via a concomitant induction of ASB9 by LH. Western blot results show that ASB9 expression in GC in vitro is increased 12 hours after treatment with LH (P<0.05). Furthermore, the phosphorylation profile of MAPK3/1 (ERK1/2) in thrombin-treated GC suggests a PAR1- mediated control while the presence of ASB9 in GC appears to have a negative effect on the MAPK pathway. Finally, thrombin could block the negative effect of ASB9 on PAR1 very early (within 1-hour treatment) while this protease does not seem to affect ASB9 effect at 6 and 12 hours of treatment. Proliferation assays showed that ASB9 negatively regulates GC number as well as proliferation marker CCND2 while apoptosis marker BAX2 was increased with LH treatment. Together, these data provide insights into the mode of action and functional effects of ASB9 on PAR1 regulation with consequences on GC proliferation, differentiation, and steroidogenic activity, suggesting a potent role of ASB09 in the ovulatory process in bovine species.