Exploring function and binding specificity of RAS small GTPases and their effector proteins

Abstract

Depuis leur découverte il y a plus de cinq décennies, les oncoprotéines HRAS, KRAS et NRAS ont fait l'objet de recherches approfondies. Selon la base de données, American Association for Cancer Research (AACR), les mutations de ces GTPases RAS sont fréquentes dans une proportion importante de cancers, en particulier dans les trois principales causes de décès liés au cancer dans le monde, à savoir le cancer du poumon, le cancer colorectal et le cancer pancréatique. Ces mutations oncogénétiques, principalement situées aux résidus Gly12, Gly13 et Gln61, bloquent les GTPases dans leur état actif. Lorsque les GTPases RAS sont activées, elles interagissent avec des effecteurs en aval et déclenchent diverses voies de signalisation qui régulent des processus cellulaires essentiels tels que la croissance, la prolifération, l'expression génique et l'apoptose. Les H/K/NRAS sont les membres fondateurs d'une grande famille appelée les GTPases RAS. La famille compte 160 membres, et tous les membres semblent fonctionner de manière similaire. Récemment, certains membres de cette superfamille ont fait objet d’études plus approfondies, qui ont montré leur incapacité à se lier aux nucléotides ou à hydrolyser correctement le GTP, et ont alors étés appelés pseudoGTPases. Les GTPases les plus proches des RAS, à savoir RRAS, RRAS2 et MRAS, semblent se lier aux mêmes effecteurs de RAS et activer leurs voies de signalisation en aval. Contrairement aux H/K/NRAS, RRAS, RRAS2 et MRAS ne sont pas des moteurs fréquents de cancer, mais contribuent plutôt à un groupe de maladies associées à la voie MAPK, appelées globalement RASopathies. Dans le cadre de mes études doctorales, j'ai exploré les caractéristiques biochimiques des RRAS, RRAS2 et MRAS, ce qui nous a permis d'identifier MRAS comme une pseudoenzyme. Malgré sa grande homologie avec les H/K/NRAS, nos études révèlent que MRAS est incapable de charger intrinsèquement le GTP, tant in vitro qu’à l’intérieur des cellules de mammifères. MRAS est supposé se lier à RAF ainsi que nucléer le complexe holophosphatase SHOC2-PP1Cα, nécessaire à l'activation de la voie MAPK – deux processus qui sont considérés comme directs et dépendants du GTP. Ces résultats, ainsi que la transformation oncogénique induite par MRAS ii dans des lignées cellulaires telles que NIH 3T3, ont été obtenus à l’aide de mutants synthétiques de MRAS basés sur des mutations fréquentes de RAS (G22V, Q71L). Nous montrons que ces mutants, ainsi que la mutant G23V associé aux RASopathies, sont également incapables de charger le GTP. En revanche, les mutations G22V et Q71L permettent à MRAS liée au GDP d'adopter une conformation active, où elle peut former des complexes avec RAF et le complexe SHOC2-PP1Cα, fournissant ainsi une explication des résultats précédents. Ces résultats offrent également une explication plausible du rôle du mutant G23V en tant que facteur déclenchant les RASopathies. De plus, nos travaux soulignent l'importance de caractériser systématiquement les GTPases, car même des homologues proches de RAS peuvent présenter une biochimie unique qui passe inaperçue autrement. Dans ma thèse de recherche, j'ai également exploré la question de la spécificité des interactions entre GTPases et effecteurs. Bien qu’il est connu que les effecteurs de RAS se lient aux GTPases RAS via les domaines de liaison à Ras (RBD), des preuves récentes suggèrent que certains effecteurs canoniques ainsi que les protéines contenant un RBD peuvent interagir avec des GTPases autres que RAS. De plus, le changement d'un seul acide aminé peut modifier de manière significative les affinités de liaison. Cela est particulièrement évident pour ARAF et BRAF, deux isoformes de la famille des kinases sérine/thréonine RAF, qui représentent les effecteurs de RAS les mieux étudiés. J'ai examiné les interactions par paires entre la famille des GTPases RRAS et les RBD d'ARAF et de BRAF, et j'ai constaté que bien qu'ARAF et BRAF présentent une plus grande affinité pour KRAS, elles montrent des préférences distinctes pour les GTPases RRAS. Les données ITC ont révélé qu'ARAF avait une affinité plus forte pour RRAS, tandis que BRAF pour RRAS2. J'ai également déterminé que l'interaction RRAS-RAF est conservée pour les orthologues chez C. elegans, LIN-45/Raf lié à RAS-1 (RRAS/2) et LET-60/RAS, avec des affinités similaires. Bien que les études biochimiques sur les protéines de C. elegans soient peu nombreuses, leur utilisation en tant qu'organisme modèle pour comprendre les associations génétiques a été précieuse pour examiner les voies de signalisation, y compris la voie MAPK en aval de RAS/LET-60 et RAF/LIN-45. Les données disponibles suggèrent une association entre SOC-2/SHOC-2 et RAS-1 dans le développement vulvaire de C. elegans, ce qui est cohérent avec un lien dans la régulation de la voie MAPK. Étant donné que MRAS est une pseudoenzyme conservée et compte tenu de iii l'interaction préservée RRAS-RAF à travers les espèces, RRAS/2 pourraient être explorés comme possibles nucléateurs du complexe SHOC2-PP1Cα, ce qui n'a pas encore été envisagé. Dans l'ensemble, ces études fournissent de nouvelles observations sur MRAS, une pseudoenzyme étroitement liée à RAS, ainsi que de nouvelles pistes à explorer pour le partenaire GTPase dans le complexe SHOC2-PPICα. De plus, ces résultats soulignent l'importance d'examiner systématiquement la fonction des protéines, les subtilités de la fonction enzymatique des GTPases et les interactions avec leurs protéines effectrices. Since their discovery over five decades ago, the oncoproteins HRAS, KRAS, and NRAS have been the subject of extensive research. As per the American Association for Cancer Research (AACR), mutations in these RAS GTPases are prevalent in a significant proportion of cancers, particularly in the three leading causes of cancer-related deaths worldwide, namely lung, colorectal, and pancreatic carcinomas. These oncogenic mutations, primarily located at residues Gly12, Gly13, and Gln61, lock the GTPases into their active state. When active, RAS GTPases engage with downstream effectors and initiate diverse signaling pathways that regulate essential cellular processes like growth, proliferation, gene expression, and apoptosis. H/K/NRAS are the founding members of a large family of 160 small RAS GTPases that are all postulated to function in a similar manner. Recently, members of the RAS superfamily have been characterized to lack either the ability to bind nucleotides, or properly hydrolyze GTP, and have been coined pseudoGTPases. The most proximal GTPases to RAS, RRAS, RRAS2, and MRAS are postulated to bind RAS effectors and activate their downstream signalling pathways. Unlike H/K/NRAS, RRAS, RRAS2, and MRAS are not frequent drivers of cancer, and instead contribute to a group of MAPK pathway associated diseases, globally referred to as RASopathies. In my doctoral studies, I explored the biochemical characteristics of the RRAS, RRAS2, and MRAS, which led us to the identification of MRAS as pseudoenzyme. Despite its close homology to H/K/NRAS, our studies reveal that MRAS is unable to intrinsically load GTP both in vitro and in mammalian cells. MRAS is proposed to bind RAF and to nucleate SHOC2 PP1Cα holophosphatase, necessary for MAPK activation – both of which are presumed to be direct and GTP-dependent. These findings, along with the observed MRAS induced transformation of cell lines, such as NIH 3T3 have relied on synthetic MRAS mutants based on RAS hotspot mutations (G22V, Q71L). We show these mutants, as well as a RASopathy associated G23V mutant are likewise unable to become GTP-loaded. Instead, G22V and Q71L mutations allow the GDP-bound protein to sample in an active conformation, whereby it can form complexes with RAF and the SHOC2 PP1Cα and provide a justification for the previous findings. They also provide a plausible explanation of how the G23V mutant can be a driver of RASopathies. Moreover, the findings of our work emphasize the importance of systematically characterizing GTPases, as even close homologs of RAS can have unique biochemistry that are otherwise unnoticed. In this thesis I also explored the question of specificity in GTPase -effectors interactions. While RAS effectors are known to bind RAS GTPases through Ras Binding Domains (RBDs), recent evidence suggests that some canonical effectors and RBD-containing proteins can interact with GTPases other than RAS. Moreover, single amino acid changes can significantly alter binding affinities. This is particularly evident in ARAF and BRAF, two isoforms of RAF serine/threonine kinase family which are amongst the best studied RAS effectors. I examined the pairwise interactions between RRAS family of GTPases with the ARAF and BRAF RBD and found that although ARAF and BRAF displayed a stronger affinity for KRAS, they showed distinct preferences for RRAS GTPases. ITC data revealed that ARAF displayed a higher affinity for RRAS and BRAF for RRAS2. I also determined that the RRAS-RAF interaction is conserved in the C. elegans orthologs, LIN-45/Raf bound RAS-1 (RRAS/2) and LET-60/RAS with similar affinities. Though biochemical studies of C. elegans proteins are not abundant, their use as a model organism to understand genetic associations has been invaluable in examining signalling pathways, including the MAPK downstream of RAS/LET-60 and RAF/LIN-45. Available data suggests an association between SOC-2/SHOC-2 and RAS-1 in C. elegans vulval development consistent with a link in MAPK regulation. MRAS being a conserved pseudoenzyme and considering the RRAS-RAF preserved interaction across species, RRAS/2 could be explored as a potential nucleator of the SHOC2 PP1Cα complex, which has not been considered so far. Altogether, these studies provide novel observations of MRAS which is a pseudoenzyme closely related to RAS and new avenues to explore for a GTPase partner of the SHOC2 PPICα complex. Additionally, it emphasizes the importance of thoroughly and systematically examining protein function, the intricacies of enzymatic function of GTPases and the interactions with their effector proteins.