Développement et conception de systèmes biocatalytiques en flux continu en utilisant l'enzyme cytochrome P450 BM3 pour la biosynthèse

Abstract

Cette thèse vise à développer des perspectives pour l'applicabilité de l'enzyme de type oxydoréductase cytochrome P450 BM3 pour la synthèse de molécules à haute valeur ajoutée. Cette enzyme est prisée pour sa sélectivité lors d’étapes d’oxydation en synthèse de molécules pharmaceutiques et de chimie fine. Toutefois, cinq défis majeurs limitent actuellement son application industrielle : la dépendance coûteuse au cofacteur Nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADPH), la faible stabilité de l'enzyme, la limitation en oxygène dissous dans la phase aqueuse, la production indésirable de peroxyde d'hydrogène et la solubilité limitée des substrats en phase aqueuse. Pour surmonter ces défis, trois bioréacteurs enzymatiques en flux continu innovants ont été conçus et évalués. Le premier est un photo-bioréacteur à lit fixe de forme plate, qui s’adresse aux défis de stabilité enzymatique, de coût du NADPH et de solubilité des substrats grâce à l'immobilisation de l'enzyme et à l'utilisation d'un donneur d'électrons sacrificiel couplé à un photosensibilisateur. Le deuxième réacteur est un bioréacteur à lit fluidisé cylindrique vertical, qui s’adresse à la stabilité enzymatique, à la limitation en oxygène dissous, à la production de peroxyde d'hydrogène et à la solubilité des substrats via un système triphasique avec recyclage enzymatique du NADPH et décomposition enzymatique du peroxyde d’hydrogène. Finalement, le troisième réacteur combine les avantages des deux premiers réacteurs, intégrant un module d'éclairage pour la photo-activation et une configuration à lit fluidisé pour une catalyse enzymatique optimale. Les résultats démontrent une amélioration significative de l'efficacité catalytique et de la stabilité opérationnelle du P450 BM3 dans ces systèmes innovants. Cette thèse ouvre de nouvelles perspectives pour l'utilisation du P450 BM3 dans des applications industrielles variées grâce à une approche multidisciplinaire combinant biologie, chimie et génie des procédés. This thesis aims to develop perspectives for the applicability of the oxidoreductase-type enzyme cytochrome P450 BM3 for the synthesis of high value-added molecules. This enzyme is prized for its selectivity during oxidation steps in the synthesis of pharmaceutical molecules and fine chemicals. However, five major challenges currently limit its industrial application: the costly dependence on the cofactor Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH), the low stability of the enzyme, the limitation of dissolved oxygen in the aqueous phase, the undesirable production of hydrogen peroxide, and the limited solubility of substrates in the aqueous phase. To overcome these challenges, three innovative continuous-flow enzymatic bioreactors were designed and evaluated. The first is a flat-shaped fixed-bed photo-bioreactor, which addresses the challenges of enzyme stability, NADPH cost, and substrate solubility through enzyme immobilization and the use of a sacrificial electron donor coupled with a photosensitizer. The second reactor is a vertical cylindrical fluidized-bed bioreactor, which addresses enzyme stability, dissolved oxygen limitation, hydrogen peroxide production, and substrate solubility via a three-phase system with enzymatic recycling of NADPH and enzymatic decomposition of hydrogen peroxide. Finally, the third reactor combines the advantages of the first two reactors, integrating a lighting module for photo-activation and a fluidized-bed configuration for optimal enzymatic catalysis. The results demonstrate a significant improvement in the catalytic efficiency and operational stability of P450 BM3 in these innovative systems. This thesis opens new perspectives for the use of P450 BM3 in various industrial applications through a multidisciplinary approach combining biology, chemistry, and process engineering.