Développement d’un produit cellulaire encapsulé et pharmaco-optimisé pour le traitement des maladies ischémiques

Abstract

Les maladies ischémiques représentent un problème de santé publique majeur en raison de leurs taux élevés de prévalence et mortalité. L’utilisation des cellules stromales mésenchymateuses (CSM) dans une approche thérapeutique est considérée comme une option très prometteuse ouvrant la voie à des thérapies innovantes capables de stimuler à la fois la reperfusion et la régénération des tissus endommagés ainsi qu’améliorer le pronostic vital des patients atteints des maladies ischémiques chroniques. Cependant, leur efficacité clinique doit être encore améliorée, car de nombreuses études observent une mortalité massive des cellules, une faible rétention ainsi qu’une grande variabilité de l’efficacité thérapeutique des cellules. De plus, les défis liés à la standardisation des protocoles et aux coûts élevés des thérapies autologues nécessitent de trouver d’autres stratégies accessibles pour maximiser leur efficacité et diminuer les coûts de production de traitement. L’objectif de cette thèse était de concevoir une version optimisée d’un produit cellulaire composé de microbilles injectables et cryopréservables chargées de CSM préconditionnées, prêtes à être utilisées pour des thérapies allogéniques des maladies ischémiques. Dans le développement de ce produit cellulaire, nous avons combiné deux technologies prometteuses à savoir l’encapsulation cellulaire et le préconditionnement pharmacologique avec le célastrol, un antioxydant naturel. Ces travaux ont été réalisés en trois phases. D’abord, nous avons évalué l’efficacité du préconditionnement pharmacologique du célastrol sur des CSM de rat et humaines encapsulées dans un hydrogel volumique de chitosane, in vitro et dans un modèle animal sain à la suite d’une injection sous-cutanée. Les résultats confirment que le préconditionnement avec 1 μM améliore significativement la viabilité et l’activité proangiogénique des CSM, ce qui se traduit par la formation de vaisseaux dans la zone d’implantation après 7 jours in vivo. Nous avons ensuite examiné l’influence de la composition des hydrogels (chitosane, chitosane-gélatine et alginate), du préconditionnement (1 et 0,1 μM) et de la conservation sur l’injectabilité, les propriétés mécaniques et l’activité proangiogénique des CSM encapsulées dans des microbilles obtenues par la méthode d’émulsification. Les cellules encapsulées dans des microbilles à base de chitosane iv ont considérablement amélioré la viabilité et la libération de VEGF par rapport aux microbilles d’alginate. Les CSM prétraitées (0,1 μM) et encapsulées dans des microbilles de chitosane-gélatine forment un produit cellulaire injectable à travers une aiguille 23 G. Ce produit cellulaire résiste à une compression pouvant atteindre 80 % et conserve leurs propriétés proangiogéniques des cellules après congélation. En poursuivant nos recherches, nous avons développé une méthode de fabrication des microbilles sans huile fonctionnant avec un système coaxial à flux d’air. Cette méthode a permis de fabriquer des microbilles d’alginate-gélatine stériles et injectables, présentant une distribution de taille étroite et une excellente viabilité. Les CSM encapsulées dans les microbilles d’alginate-gélatine ont montré une meilleure fonction paracrine en stimulant la prolifération et la migration des cellules endothéliales dans un modèle de coculture in vitro par rapport aux microbilles d’alginate. Après cryopréservation, ces microbilles peuvent être injectées avec une aiguille 21G. Elles résistent à une compression allant jusqu’à 50 % tout en conservant leurs fonctions paracrines, qui sont proches des cellules fraîches. En conclusion, cette thèse présente une solution innovante et prometteuse permettant d’améliorer l’activité proangiogénique des CSMs, ce qui est essentiel pour le traitement des maladies ischémiques. Ces recherches s’inscrivent dans une démarche visant à transformer la thérapie cellulaire en une solution accessible, standardisée, ouvrant ainsi la voie à des thérapies cellulaires plus efficaces et conformes aux exigences des traitements allogéniques. Ischemic diseases represent a major public health problem due to their high prevalence and mortality rates. The use of mesenchymal stromal cells (MSCs) in a therapeutic approach is considered a very promising option, paving the way for innovative therapies capable of stimulating both reperfusion and regeneration of damaged tissue, as well as improving the vital prognosis of patients suffering from chronic ischemic diseases. However, their clinical efficacy needs to be further improved, as numerous studies have observed massive cell mortality, low retention and high variability in cellular efficacy. In addition, the challenges of standardizing protocols and the high costs of autologous therapies call for alternative strategies to maximize efficacy and reduce the production costs. The aim of this thesis was to design an optimized version of a cell product composed of injectable and cryopreservable microbeads loaded with preconditioned MSCs, ready to use in allogeneic therapies for ischemic diseases. In developing this cell-based product, we combined two promising technologies: cell encapsulation and pharmacological preconditioning with celastrol, a potent natural antioxidant. This work was carried out in three phases. First, we examined the effects of pharmacological preconditioning with the natural antioxidant celastrol on encapsulated rat and human (bone marrow-derived) MSCs in vitro and in a healthy animal model after subcutaneous injection. The results demonstrated that preconditioning with 1 μM significantly improved MSC viability and pro-angiogenic activity, leading to the formation of vessels in the implantation area after 7 days in vivo. Our research explored the effect of hydrogel composition (chitosan, chitosan-gelatin, alginate), preconditioning (1 and 0.1 μM), and cryogenic storage on the injectability, mechanical properties, and pro-angiogenic potential of MSC encapsulated in microspheres through emulsification. We found that MSCs encapsulated in chitosan-based microspheres exhibited a significant enhancement in viability and VEGF release compared to those encapsulated in alginate microspheres. Preconditioned MSCs (0.1 μM) encapsulated in chitosan-gelatin microbeads form a cellular product that can be injected through a 23-gauge needle. They can withstand up to 80% compression, maintaining their pro-angiogenic function even after cryopreservation. We continued our research, developing an oil-free microbead fabrication method using an air assisted coaxial system. This method made it possible to manufacture sterile, injectable alginate-gelatin microbeads with a lower size distribution and excellent viability. MSCs loaded alginate-gelatin microbeads showed enhanced paracrine function by stimulating endothelial cell proliferation and migration in an in vitro coculture model, compared with alginate microbeads. After cryopreservation, these microbeads can be injected with a 21G needle. They withstand compression of up to 50% while retaining their paracrine functions, which is close to those of fresh cells. In conclusion, this thesis presents an innovative and promising solution for enhancing the pro-angiogenic activity of MSCs, which is essential for the treatment of ischemic diseases. This research is part of an approach aimed at transforming cell therapy into an accessible, standardized solution, paving the way for more effective cell therapies that meet the requirements of allogeneic treatments.