Impact de la qualité de la nutrition parentérale néonatale sur l’interrelation à court et à long terme entre les métabolismes du glutathion, du peroxyde d’hydrogène endogène et la méthylation génique chez le cochon d’Inde

Abstract

Problématique: La nutrition parentérale (NP) telle qu’administrée aux unités de soins de néonatologie apporte les nutriments essentiels à la croissance et au développement des nouveau-nés qui sont incapables d’assimiler une alimentation entérale; cependant, elle est contaminée intrinsèquement par des molécules oxydantes (peroxydes) générées par l’interaction de ses composants. Les peroxydes induisent l’augmentation du potentiel redox du couple GSSG/2GSH, reflétée par un état cellulaire oxydé et caractéristique de la présence d’un stress oxydant non-radicalaire. En effet, les peroxydes diminuent les niveaux du glutathion, ce qui entraine la diminution de la capacité antioxydante de ces nouveau-nés, les rendant très vulnérables aux dommages oxydants. Ces dommages oxydants ont été associés à des altérations du métabolisme du glucose et des lipides, celui-ci étant modulé par le métabolisme du peroxyde d’hydrogène (H2O2) endogène et l’environnement redox de la cellule. Ces altérations du métabolisme énergétique constituent l’un des facteurs de risque de développement des maladies chroniques de type cardiométaboliques. Par ailleurs, de nombreuses études indiquent une prévalence précoce et plus élevée des maladies cardiométaboliques chez les individus nés prématurément. Cette prévalence serait liée à une reprogrammation métabolique consécutive à la modulation épigénétique, notamment des mécanismes de méthylation de l’ADN qui influencent la transcription génique. L’hypothèse émise est que le stress oxydant, initié par les peroxydes générés dans la NP néonatale, induit une reprogrammation permanente du métabolisme endogène du H2O2 et du glutathion, maintenant un stress oxydant non-radicalaire de manière chronique. Cet état d’oxydation chronique serait à l’origine de perturbations du métabolisme énergétique observées chez les sujets nés prématurément. L’objectif principal de cette thèse était d’étudier l’impact des peroxydes de la NP néonatale sur les liens mécanistiques entre les métabolismes du glutathion, du peroxyde d’hydrogène endogène et de la méthylation de l’ADN. Méthodes: Des cochons d’Inde nouveau-nés, âgés de 3 jours de vie étaient randomisés dans plusieurs groupes, nourris soit avec une diète standard (témoins) per os, soit avec la NP via un cathéter fixé dans la veine jugulaire. Pour tester les objectifs spécifiques énoncés dans la première étude de cette thèse, la NP était enrichie avec deux types d’émulsions lipidiques (Intralipid ou Smoflipid) et les solutions de NP étaient protégées ou non de la lumière. Dans la deuxième étude, les solutions de NP étaient supplémentées en glutathion disulfure (GSSG), à une concentration correspondant à 12 μM. Le GSSG a été ajouté pour servir de précurseur de la cystéine, afin d’améliorer les niveaux de glutathion chez les animaux. Les échantillons hépatiques ont été analysés 4 jours après le début de traitement (soit à 1 semaine de vie) ou 15 semaines après l’arrêt de la perfusion de la NP (soit à 16 semaines de vie), afin d’évaluer les effets à court et long terme, respectivement. Les résultats étaient comparés par une ANOVA et le seuil de signification des effets était fixé à p< 0,05. Résultats et discussion: L’administration de la NP néonatale pendant 4 jours a induit à une diminution du contenu hépatique en GSH, une augmentation du GSSG et, par conséquent, du potentiel redox du couple GSSG/2GSH, indiquant un état pro-oxydant. Cette modification du potentiel redox du glutathion dépendait des modalités nutritives. Une NP contenant l’émulsion lipidique Smoflipid a induit un état d’oxydation plus marqué dans le foie comparativement à celle contenant Intralipid. Une protection totale de ces solutions de NP contre la lumière ambiante (diminuant la génération de peroxydes) a atténué cette oxydation. Cette graduation du potentiel redox de glutathion était associée à une hyperméthylation du génome. Plus le potentiel redox était augmenté (oxydé), plus le génome était méthylé (r2 = 0,51; p<0,001). Le second article montre que cette hyperméthylation du génome affectait particulièrement le gène codant pour la glutathion peroxydase 1 (GPx1, un réducteur du H2O2). L’induction de la méthylation du génome était modulée par l’augmentation de l’activité des ADN méthyltransférases (DNMTs) en particulier, l’expression protéique des isoformes de la DNMT3a. L’augmentation du potentiel redox du glutathion a également modulé positivement le ratio S-adénosyl-méthionine (SAM)/S-adénosyl-homocystéine (SAH), respectivement, substrat et inhibiteur des méthyltransférases. À court terme, la NP a induit l’inhibition de la transcription de la GPx1 ainsi que de gènes impliqués dans la synthèse du glutathion, la glutamate-cystéine ligase (GCLC) et la glutathion synthétase (GSase). Ces données suggèrent une incapacité de la GPx1 de détoxifier les peroxydes, associée à une diminution de la synthèse endogène du glutathion, ce qui initie un stress oxydant. À long terme, les résultats montrent les effets similaires et délétères de la NP, à savoir une hyperméthylation de la GPx1 et une inhibition de la transcription des gènes GPx1, GCLC et GSase, indiquant la reprogrammation du métabolisme du H2O2. Par ailleurs, La supplémentation de la NP avec du glutathion disulfure (GSSG) a limité le stress oxydant en améliorant la réponse antioxydante à travers l’activation de la transcription du NRF2 (pour Nuclear factor erythroid-derived 2-like 2), ce qui a favorisé l’activation de l’expression des gènes impliqués dans cette réponse, à savoir la superoxyde dismutase (SOD2), la GPx1, la GCLC et la GSase. Conclusion: Les résultats de cette thèse suggèrent que le stress oxydant non-radicalaire initié par les peroxydes présents dans la NP néonatale et reflété par l’augmentation du potentiel redox du glutathion, reprogramme le métabolisme endogène du H2O2 à travers les modifications de la méthylation génique. Ces changements semblent être maintenus de manière permanente, au moins jusqu’à 15 semaines après l’arrêt de l’administration de la NP, ce qui pourrait expliquer les altérations du métabolisme énergétique observées à long terme dans les maladies cardiométaboliques des individus nés prématurément. Ces données montrent également que la supplémentation du glutathion sous sa forme oxydé (GSSG) dans la NP constitue une approche efficace et simple pour limiter le stress oxydant et ses conséquences subséquentes, notamment chez les prématurés, à la suite de l’administration d’une NP tel que procédé dans les unités des soins de néonatalogie. Introduction: Parenteral nutrition (PN) as administered in neonatal care units provides essential nutrients for the growth and development of newborns unable to assimilate enteral nutrition. However, it inherently carries contamination from oxidizing molecules (peroxides) generated by the interaction of its components. These peroxides disrupt the equilibrium of the glutathione (reduced/disulfide) redox potential which shifts to a more oxidized status and constitutes a key marker of free-radical oxidative stress. Indeed, peroxides decrease glutathione levels, compromising the antioxidant capacity of these newborns, making them very vulnerable to oxidative damages. These damages haven been associated with disruptions in glucose and lipid metabolisms, which signaling pathways are modulated by endogenous hydrogen peroxide (H2O2) metabolism and the redox environment of the cell. These metabolic alterations contribute to the risk of chronic cardio-metabolic diseases, a risk that is notably higher and manifests earlier in formerly premature infants and, this risk is thought to result from metabolic reprogramming driven by epigenetic changes, particularly in DNA methylation, which regulate gene transcription. The proposed hypothesis is that oxidative stress, initiated peroxides generated in neonatal PN, leads to a permanent reprogramming of glutathione and the endogenous H2O2 metabolisms, thereby maintaining a chronic non-radical pro-oxidant environment. This chronic oxidative state is believed to underlie the disturbances in energy metabolism observed in formerly premature infants. Thus, the principal objective of this thesis was to investigate the impact of neonatal PN-derived peroxides on the mechanistic links between the metabolism of glutathione, endogenous H2O2, and DNA methylation. Methods: Newborn guinea pigs, aged 3 days old, were randomly assigned to various groups, receiving either a standard diet (controls) per os or parenteral nutrition (treated) via a catheter inserted into the jugular vein. To test the specific objectives stated in the first study of this thesis, PN solutions were enriched with two types of lipid emulsions (Intralipid or Smoflipid) and the bags were shield or exposed to room light. The second study aimed at examining the effects of supplementing PN solutions with glutathione in its oxidized form (GSSG) used as a cysteine precursor at concentration corresponding to 12 μM of GSSG. The liver samples were analyzed either 4 days after the start of treatment (at 1 week of life) or 15 weeks after stopping PN administration (at 16 weeks of life), to assess short- and long-term effects, respectively. Statistical comparisons were conducted using ANOVA, with a significance threshold set at p<0.05. Results: The administration of neonatal PN over a 4-day period resulted in depletion of hepatic reduced glutathione (GSH) and an increase in oxidized glutathione (GSSG) levels while the GSSG/2GSH redox potential balance was at an oxidative state. The modification of glutathione redox potential was influenced by the nutritional modalities. Notably, PN containing the lipid emulsion Smoflipid led to more pronounced oxidation environment compared to Intralipid. Photoprotection of these PN solutions, which limits peroxide formation, mitigated the oxidation. The increased of glutathione redox potential correlated with global genome hypermethylation. A direct and positive relationship was observed between the increase in glutathione redox potential oxidation and the genome methylation (r2 = 0.51; p<0.001). As the glutathione redox potential become more oxidized, the more the genome was methylated. The second article demonstrated that the genome hypermethylation specifically impacted the gene encoding glutathione peroxidase 1 (GPx1, a key enzyme involved in the reduction of H₂O₂). Genome methylation induction was mediated through increased activity of DNA methyltransferases (DNMTs), and particularly through the protein expression of DNMT3a isoforms. Additionally, elevated glutathione redox potential positively influenced the S-adenosyl-methionine (SAM) to S-adenosyl-homocysteine (SAH) ratio, with SAM acting as a substrate and SAH as an inhibitor of methyltransferases. In the short-term, PN induced transcriptional inhibition of GPx1 as well as genes involved in glutathione synthesis, such as glutamate-cysteine ligase (GCLC) and glutathione synthetase (GSase). These findings suggest that GPx1's ability to detoxify peroxides was impaired, coupled with a decrease in endogenous glutathione synthesis, thus initiating an oxidative stress. In the long-term, similar detrimental effects were observed, including hypermethylation of GPx1 and inhibition of transcription of GPx1, GCLC, and GSase genes indicating a sustained reprogramming of H2O2 metabolism. Furthermore, supplementing PN with glutathione (GSSG) effectively mitigated oxidative stress by enhancing the antioxidant response through the activation of NRF2 (Nuclear factor erythroid-derived 2-like 2). This, in turn, promoted the expression of genes involved in the antioxidant response, including superoxide dismutase 2 (SOD2), GPx1, GCLC, and GSase. Conclusion: The results from this thesis suggest that the non-radical oxidative stress initiated by peroxides present in neonatal PN and reflected by an increase in the redox potential of glutathione, reprograms the endogenous H2O2 metabolism through changes in gene methylation. These changes appear to be persistent over time, at least up to 15 weeks after stopping PN infusion. This persistence could help explain the long-term disruptions in energy metabolism observed and linked to chronic cardiometabolic diseases in individuals born prematurely. Moreover, the data also underscore the efficacy of using glutathione (GSSG) in PN solutions. This approach emerges as an effective means to prevent and mitigate the non-radical oxidative stress instigated by peroxides contaminating PN.