Functions of tribbles (TRIB) pseudokinase proteins in the bovine ovary
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Mots-clés
- Bovin
- Fertilité
- Bovine
- Follicular development
- Granulosa cells
- Ovaire
- Développement folliculaire
- Cellules de granulosa
- Ovulation
- TRIB
- Prolifération
- CRISPR/Cas9
- MAPK
Organisme subventionnaire
Résumé
Résumé
La croissance folliculaire anormale, l'anoestrus et l'anovulation sont parmi les principales causes de la baisse de fertilité chez les bovins laitiers à haut rendement. Lors de la croissance folliculaire et de l'ovulation, les cellules stéroïdogènes, y compris les cellules de granulosa (GC), jouent un rôle crucial dans la maturation et la libération de l'ovocyte. Il est donc essentiel de décrire en détail les processus physiologiques et pathologiques régulant la fonction ovarienne. Des études précédentes de notre laboratoire ont identifié et caractérisé pour la première fois un membre de la famille des pseudo-kinases Tribbles (à savoir TRIB2) dans les cellules ovariennes de granulosa. La famille Tribbles comprend des protéines de type sérine-thréonine kinase largement exprimées (TRIB1, TRIB2 et TRIB3) qui peuvent jouer des rôles cruciaux dans divers processus biologiques tels que la coordination de la mitose et de la morphogenèse, la maturation des ovocytes et la prolifération cellulaire. Cependant, leurs rôles exacts dans la fonction des cellules de granulosa et leurs effets sur les voies de signalisation impliquées dans la croissance folliculaire et l'ovulation restent inconnus. Nous avons émis l'hypothèse que les pseudo-kinases TRIB jouent des rôles cruciaux dans la régulation de la fonction et de l'activité des cellules de granulosa au cours des dernières étapes du développement folliculaire et peuvent activer des voies de signalisation distinctes. L'objectif de la présente étude était donc d'examiner les fonctions des membres TRIB dans les cellules de granulosa bovine avec les objectifs spécifiques suivants : 1) Analyser l'expression et la régulation des membres TRIB dans différents types cellulaires folliculaires et modèles de culture ; 2) Étudier les fonctions des membres TRIB dans les cellules GC en utilisant l'approche CRISPR/Cas9. En utilisant un modèle d'étude in vivo composé de cellules GC obtenues à partir de follicules à différents stades de développement, nous avons confirmé la régulation négative de TRIB2 par l'hormone lutéinisante (LH) / hormone chorionique gonadotrope humaine (hCG) et la régulation positive de TRIB1 et TRIB3 aux niveaux de l'ARN et des protéines par la LH. Nous avons montré que TRIB2 est presque exclusivement présent dans les cellules GC et dans les follicules dominants (DF) alors qu'il est absent dans les cellules de la thèque (TC) et régulé négativement dans les follicules ovulatoires (OF) par hCG, tandis que TRIB1 et TRIB3 sont présents dans les cellules TC des DF ou OF. TRIB1 et TRIB3 sont exprimés dans les cellules GC uniquement dans les OF post-hCG et non dans les DF. Les résultats suggèrent que la contribution des cellules TC à l'expression de TRIB2 dans l'ovaire bovin est très limitée par rapport aux cellules GC. Nos données ont montreé que TRIB1 et TRIB3 sont induits par hCG, suggérant des rôles significatifs, respectivement, dans le processus d'ovulation ou la formation et la fonction du corps jaune. Les résultats d'immunohistochimie ont montré la présence de TRIB2 dans la couche GC des DF par rapport à la couche TC et absente dans les OF post-hCG. L'analyse par Western blot a montré que TRIB2 et TRIB3 sont induits par la FSH mais à des moments différents. De plus, les données in vitro ont confirmé que la LH supprime l'expression de TRIB2, tandis que l'expression de TRIB3 est induite par la LH, en particulier 6 heures après le traitement avec LH. L'inhibition de TRIB3 via CRISPR/Cas9 suggère que, bien que TRIB3 puisse avoir un effet positif sur la voie de signalisation AKT dans les cellules GC, il a des effets négatifs sur la voie de signalisation P38MAPK. Nos données actuelles fournissent des preuves que TRIB2 pourrait être impliqué dans la prolifération des cellules GC et le développement folliculaire, tandis que TRIB1 et TRIB3 pourraient être impliqués respectivement dans les processus d'ovulation et de lutéinisation. En conclusion, les TRIB jouent des rôles cruciaux dans la régulation de la fonction et de l'activité des cellules de granulosa au cours du développement folliculaire et peuvent activer des voies de signalisation distinctes.
Abnormal follicular growth, anestrus and anovulation are among the main causes of declining fertility in high-yielding dairy cattle. During follicular growth and ovulation, steroidogenic cells, including granulosa cells (GC), play a crucial role in the maturation and release of the oocyte. It is therefore essential to describe in more details the physiological and pathological processes regulating the ovarian function. Previous studies from our laboratory identified and characterized for the first time a tribbles pseudokinase family member (namely TRIB2) in ovarian GC. The Tribbles family includes widely expressed serine-threonine kinase-like proteins (TRIB1, TRIB2 and TRIB3) that may play crucial roles in various biological processes such as coordination of mitosis and morphogenesis, oocyte maturation and cell proliferation. However, their exact roles in GC function and effects on the signaling pathways involved in follicular growth and ovulation remained to be defined. We hypothesized that TRIB pseudokinases play crucial roles in regulating the function and activity of granulosa cells during the final stages of follicular development and may activate separate signaling pathways. The aim of the present study was therefore to investigate the functions of TRIB members in bovine GC with the following specific objectives: 1) Analyze the expression and regulation of TRIB members in different follicular cell types and culture models; 2) to study TRIB members functions in GC cells using the CRISPR/Cas9 approach. Using an in vivo study model consisting of GC obtained from follicles at different stages of development, we confirmed down-regulation of TRIB2 by luteinizing hormone (LH) and human chorionic gonadotropin (hCG) and up-regulation of TRIB1 and TRIB3 at both RNA and protein levels. We showed that, TRIB2 is almost exclusively present in GC and in dominant follicles (DF) while it is absent in theca cells (TC) and downregulated in ovulatory follicles (OF) by hCG while TRIB1 and TRIB3 are present in TC whether of DF or OF. Both TRIB1 and TRIB3 are expressed in GC only in OF post-hCG and not in DF. The results suggest that TC contribution to TRIB2 expression in the ovary is very limited as compared to GC. Our data show that TRIB1 and TRIB3 are induced by hCG suggesting significant roles in the ovulation process (TRIB1) or the formation and function of the corpus luteum. Results from immunohistochemistry, showed the presence of TRIB2 in the GC layer of DF as compared to TC layer and absent in OF post hCG injection. Western blot analysis showed that TRIB2 and TRIB3 are induced by FSH but at different times. Moreover, in vitro data confirmed that LH suppresses TRIB2 expression, whereas TRIB3 expression is induced by LH, particularly 6 hours post-LH treatment. Inhibition of TRIB3 via CRISPR-Cas9 suggested that while TRIB3 might have positive effect on AKT signaling pathway in GC, it has negative effects on P38 signaling pathway. Our current data provide evidence that TRIB2 could be involved in GC proliferation and follicular development while TRIB1 and TRIB3 could be involved in the ovulation and luteinization processes, respectively. Overall, TRIBs play crucial roles in regulating the function and activity of granulosa cells follicular development and may activate separate signaling pathways.
Abnormal follicular growth, anestrus and anovulation are among the main causes of declining fertility in high-yielding dairy cattle. During follicular growth and ovulation, steroidogenic cells, including granulosa cells (GC), play a crucial role in the maturation and release of the oocyte. It is therefore essential to describe in more details the physiological and pathological processes regulating the ovarian function. Previous studies from our laboratory identified and characterized for the first time a tribbles pseudokinase family member (namely TRIB2) in ovarian GC. The Tribbles family includes widely expressed serine-threonine kinase-like proteins (TRIB1, TRIB2 and TRIB3) that may play crucial roles in various biological processes such as coordination of mitosis and morphogenesis, oocyte maturation and cell proliferation. However, their exact roles in GC function and effects on the signaling pathways involved in follicular growth and ovulation remained to be defined. We hypothesized that TRIB pseudokinases play crucial roles in regulating the function and activity of granulosa cells during the final stages of follicular development and may activate separate signaling pathways. The aim of the present study was therefore to investigate the functions of TRIB members in bovine GC with the following specific objectives: 1) Analyze the expression and regulation of TRIB members in different follicular cell types and culture models; 2) to study TRIB members functions in GC cells using the CRISPR/Cas9 approach. Using an in vivo study model consisting of GC obtained from follicles at different stages of development, we confirmed down-regulation of TRIB2 by luteinizing hormone (LH) and human chorionic gonadotropin (hCG) and up-regulation of TRIB1 and TRIB3 at both RNA and protein levels. We showed that, TRIB2 is almost exclusively present in GC and in dominant follicles (DF) while it is absent in theca cells (TC) and downregulated in ovulatory follicles (OF) by hCG while TRIB1 and TRIB3 are present in TC whether of DF or OF. Both TRIB1 and TRIB3 are expressed in GC only in OF post-hCG and not in DF. The results suggest that TC contribution to TRIB2 expression in the ovary is very limited as compared to GC. Our data show that TRIB1 and TRIB3 are induced by hCG suggesting significant roles in the ovulation process (TRIB1) or the formation and function of the corpus luteum. Results from immunohistochemistry, showed the presence of TRIB2 in the GC layer of DF as compared to TC layer and absent in OF post hCG injection. Western blot analysis showed that TRIB2 and TRIB3 are induced by FSH but at different times. Moreover, in vitro data confirmed that LH suppresses TRIB2 expression, whereas TRIB3 expression is induced by LH, particularly 6 hours post-LH treatment. Inhibition of TRIB3 via CRISPR-Cas9 suggested that while TRIB3 might have positive effect on AKT signaling pathway in GC, it has negative effects on P38 signaling pathway. Our current data provide evidence that TRIB2 could be involved in GC proliferation and follicular development while TRIB1 and TRIB3 could be involved in the ovulation and luteinization processes, respectively. Overall, TRIBs play crucial roles in regulating the function and activity of granulosa cells follicular development and may activate separate signaling pathways.
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