Chaînes libres de polyubiquitines liées sur lysine 63 : un nouveau second messager impliqué dans les événements précoces de la signalisation inflammatoire des récepteurs couplés aux protéines G

Abstract

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) constituent la plus grande famille de récepteurs membranaires. Les RCPGs activés par des molécules vasoactives comme l'angiotensine II (Ang II), l'acide lysophosphatidique (LPA) et la thrombine (Thr) peuvent déclencher des réponses inflammatoires suivant, entre autres, l’activation de deux familles de facteurs de transcription: NF-kappaB (facteur nucléaire kappa-light-chain-enhancer of activated B cells) et AP-1 (protéine activatrice 1). La signalisation médiée par les RCPGs est ainsi particulièrement cruciale dans des maladies telles que l'athérosclérose, où l'inflammation chronique incontrôlée pose un problème majeur. Quoique le facteur 6 associé au récepteur du facteur de nécrose tumorale (TRAF6), une E3 ubiquitine ligase, joue des rôles clés dans les réponses aux stimuli inflammatoires classiques (IL-1beta) et suivant l’activation des récepteurs des cellules B (BCR), son rôle dans la signalisation inflammatoire médiée par les RCPGs reste à élucider. Suivant de courtes stimulations aux LPA et Thr, les extraits cellulaires provenant de cellules dépourvues de TRAF6 (MEFs TRAF6-/-) et de cellules génétiquement modifiées surexprimant un domaine de liaison de chaine de polyubiquitine libres (HACAT-ZnF-4xUBP) ont été purifiés et soumis à des analyses par immunoprécipitation et immunobuvardages (extraits protéiques) ou analyse RT-qPCR (ARN). Nos résultats démontrent que l’activation des cascades signalétiques composées de TAK1-IKKbeta-NF-kappaB de même que TAK1-JNK1/2-p38-AP-1 est significativement diminuée en absence de TRAF6. Nos résultats suggèrent également que TRAF6 est responsable de la genèse de chaines libres de polyubiquitines liées à la lysine 63, lesquelles se retrouvent dans les immmunocomplexes composés de TAK1 et IKKkappa et contrôlent l’expression des gènes à réponse rapide FOS et EGR1. Suivant la production rapide et transitoire de chaines libres de polyubiquines par TRAF6, nos résultats démontrent que TRAF6 est un effecteur important de la réponse des RCPGs inflammatoires. Nous proposons que la genèse rapide et transitoire de chaines libres de polyubiquines pourrait être considérée comme un nouveau second messager. G protein-coupled receptors (GPCRs) are part of the largest family of membrane receptors. GPCRs activated by vasoactive molecules such as angiotensin II (Ang II), lysophosphatidic acid (LPA), and thrombin (THR) can trigger inflammatory responses through, among others, the activation of two families of transcription factors: NF-κB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated b cells) and AP-1 (activator protein 1). GPCR-mediated signaling is therefore particularly crucial in diseases such as atherosclerosis, where uncontrolled chronic inflammation is a major link to the development of the disease. Although tumor necrosis factor receptor-associated factor 6 (TRAF6), an e3 ubiquitin ligase, plays key roles in classical inflammatory responses (e.g., IL-1β) and B cell receptor (BCR) activation, its role in GPCR-mediated inflammatory signaling remains to be clarified. Following short stimulations with LPA and THR, cell extracts from traf6-deficient cells (TRAF6-/- MEFs) and genetically modified cells overexpressing a free polyubiquitin chain-binding domain (HACAT-ZnF4x-UBP) were purified and analyzed using immunoprecipitation and western blotting (protein extracts) or RT-qPCR (RNA). Our results demonstrate that the activation of the TAK1-IKKβ-NF-κB and TAK1-JNK1/2-p38-AP -1 signaling cascades is significantly reduced in the absence of TRAF6. Our results also suggest that TRAF6 is responsible for the generation of free lysine 63-linked polyubiquitin chains, which are found in TAK1 and IKKβ immunocomplexes and regulate the expression of early-response genes FOS and EGR1. Given the rapid and transient production of free polyubiquitin chains by TRAF6, our findings demonstrate that TRAF6 is an important effector in GPCR-induced inflammatory responses. We propose that the rapid and transient generation of free polyubiquitin chains could be considered a novel second messenger.