Hepatic organoid to model hereditary tyrosinemia type 1 and evaluate alternative therapy

Abstract

La tyrosinémie héréditaire de type 1 (HT1) est une maladie métabolique autosomique récessive rare causée par une déficience de l’enzyme fumaryl-acetoacetate hydrolase (FAH) impliquée dans le catabolisme de la tyrosine. Ce déficit entraine l'accumulation de métabolites toxiques pouvant avoir différents impacts cliniques. Les patients atteints de HT1 présentent une atteinte hépatique, qui peut se traduire par l’apparition d’une hépatomégalie, d’une cirrhose, menant à une insuffisance hépatique et un risque élevé de développer des cancers (foie, rein, cerveau). Le traitement de référence actuel, la nitisinone ou NTBC, prévient efficacement la formation d'intermédiaires toxiques de la dégradation de la tyrosine en inhibant une des enzymes en amont. Cependant, les patients sous NTBC doivent également suivre un régime alimentaire pauvre en tyrosine et en phénylalanine tout au cours de leur vie pour limiter l’accumulation systémique de tyrosine. En effet, une accumulation excessive de tyrosine peut mener à des troubles neurocognitifs et visuels. En raison de la nature monogénique de la HT1, la thérapie génique ou la thérapie cellulaire sont des alternatives thérapeutiques curatives évidentes. Pour autant, la littérature suggère qu’une correction incomplète de la mutation FAH laisserait les patients à risques de développer des complications. En effet, les cellules non corrigées présentaient encore une nécrose, de l’inflammation et une dysplasie des cellules hépatiques. 81,82 Ces effets sont présents puisque les hépatocytes HT1 non corriges ne métabolisme encore pas la tyrosine ce qui continue de produire des intermédiaires toxiques. Ceci continue de mettre les patients a risque. Jusqu’à aujourd’hui, les connaissances dans le domaine de la HT1 nous viennent de données cliniques et de modèles d’étude limités dans leur pertinence physiologique (modèles murins, modèles in vitro…) Par conséquent, un modèle reflétant l'environnement hépatique humain est nécessaire à l’expansion des connaissances sur la pathogenèse de la HT1 ou, encore, à l’évaluation de nouvelles thérapies avec une fiabilité translationnelle. Dans ce contexte, ce projet vise à surmonter ces limitations en établissant un modèle hépatique humain 3D de la HT1 en utilisant des cellules souches pluripotentes induites (iPSCs). Cet objectif a été rendu possible grâce aux modèles d’organoïdes hépatiques développés dans le laboratoire du Dr Paganelli, intégrant des cellules parenchymateuses et non-parenchymateuses selon un ratio qui permet de reproduire la niche hépatique. De plus, nos travaux antérieurs ont permis d'établir un modèle 2D de la HT1 avec des lignées d’iPSCs déficientes en FAH – qui proviennent de patients ou de modification génétiques – associés à leur contrôles isogéniques. En utilisant ces iPSCs présentant la mutation FAH, les résultats de ce projet montrent que les organoïdes de la HT1 se forment de manière comparable à ceux des organoïdes contrôles sous traitement NTBC. Ces organoïdes conservent une taille et une sécrétion d'albumine similaires. Après le retrait du NTBC, les organoïdes HT1 déficients en FAH présentent une réduction des taux d'ATP et une augmentation de la sécrétion d'AFP. Les résultats préliminaires de marquages en immunofluorescence ont montré une expression de la cleaved caspase-3 après le retrait de NTBC. Ce marqueur montre activation de la Capase-3 ce qui peut être associer à l’activation de la voie d’apoptose. Ce modèle pourrait alors devenir un outil pour tester différents ratios de correction d’hépatocytes. Cette application permettrait d’évaluer les mécanismes possibles mis en jeu lors d’une correction incomplète de FAH. Dans ce but, j’ai réalisé des expérimentations préliminaires de co-culture directe en 2D. Les résultats montrent une possible réduction de l'apoptose des cellules HT1 lorsque seulement 10 % de la population cellulaire était des cellules contrôles. Ensemble, ces résultats suggèrent un modèle organoïde HT1 3D potentiel, capable de répondre aux stress en enlevant NTBC. Les résultats suggèrent aussi un effet bénéfique au court terme d’une correction du déficit en FAH dans un faible pourcentage des cellules. Hereditary Tyrosinemia Type 1 (HT1) is a rare autosomal recessive metabolic disorder caused by mutations in the FAH gene, resulting in the accumulation of toxic metabolites and progressive liver damage. Clinically, HT1 manifests as hepatomegaly, cirrhosis, coagulopathy, acute-on-chronic liver failure, and a high risk of hepatocellular carcinoma (HCC). The current standard of care, nitisinone (NTBC), effectively prevents the formation of toxic intermediates by inhibiting upstream enzyme. However, it is associated with side effects including neurocognitive impairment and corneal opacities with a possible risk of HCC retained. NTBC also demands lifelong dietary burden and is not curative since it does not correct the underlying genetic defect. Due to the monogenic nature of HT1, gene or cell therapy offers a promising alternative therapy, and a lifelong cure. Cell therapy has been tested in mice but has been hypothesis that incomplete correction of the FAH mutation left mice with HCC risks. Research in HT1 field has been done using animal models mainly mice and 2D in vitro models. Traditional 2D in vitro systems fail to recapitulate the structural complexity and multicellular interactions of the liver, limiting their physiological relevance. On the other hand, animal models often diverge from human-specific pathways. As a result, neither model sufficiently reflects the human liver environment necessary to enhance the knowledge on HT1 pathogenesis or test new therapies with translational confidence. This project aims to overcome these limitations by establishing a 3D human liver organoid model of HT1 derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs). This was possible because our lab established liver organoid models that incorporate three cell types at a ratio that replicates the liver niche. Additionally, we already established a 2D model of HT1 with FAH-deficient and isogeneic control iPSC lines (Pham et al., submitted (Annex)). Using these lines with the FAH mutation, findings of this project show that HT1 organoids form comparably to controls under NTBC treatment, maintaining similar size and albumin secretion. Upon NTBC withdrawal, FAH-deficient organoids display reduced ATP levels, increased AFP secretion. Preliminary immunofluorescence staining showed possible cleaved caspase-3 expression after withdrawal. 6 This model could, in the future, be a potential tool for testing different hepatocyte correction ratios. This application would allow us to evaluate possible mechanisms of disease correction. To begin testing this potential, I set up direct 2D co-culture experiments with labeled control iPSCs. The results show a short-term beneficial survival effect upon NTBC removal when only 10% of the cell population were FAH-positive cells. Together, these results suggest a potential 3D HT1 organoid model capable of responding to stress by removing NTBC. The results also suggest that correcting FAH deficiency, even in a small percentage of hepatocytes, could be sufficient to prevent HT1-related hepatocellular injury in all cells, paving the way for new therapeutic approaches such as cell and gene therapy.