Caractérisation des rôles et des mécanismes d’action de SFRP4 et YAP1 dans l'ovaire murin

Abstract

Les gonadotrophines, soit la FSH (hormones folliculo-stimulante) et LH (hormone lutéinisante), jouent un rôle central dans la régulation de la folliculogenèse ovarienne terminale. Toutefois, bien que leurs rôles au sein de l’ovaire soient établis, leurs mécanismes de signalisation restent partiellement méconnus encore à ce jour. Tout de même, il est clair que les gonadotrophines agissent pour réguler l'expression et la fonction de différents facteurs intraovariens, y compris les glycoprotéines sécrétées WNT (Wingless-related integration site). Ces WNT agissent ensuite à leur tour de manière autocrine/paracrine pour moduler et coordonner la réponse cellulaire aux gonadotrophines. La majorité de leurs actions s’exécuteraient via la voie WNT/CTNNB1 (β-caténine) pour cibler la CTNNB1, également une protéine co-activatrice transcriptionnelle en aval du récepteur de la FSH. SFRP4 (Secreted Frizzled-Related Protein 4), un antagoniste de la voie WNT/CTNNB1 dans plusieurs types cellulaires, a été décrit comme un régulateur négatif de la fertilité. Son mécanisme d’action demeure cependant méconnu dans l’ovaire. De plus, parmi une fraction des ouvrages traitant de la dégradation de la CTNNB1, ce processus nécessiterait l’incorporation de la protéine YAP1 (Yes-associated protein 1) (effecteur intracellulaire de la voie de signalisation Hippo) sous sa forme phosphorylée. En sachant que SFRP4 et YAP1 sont exprimés dans les cellules de la granulosa et que leur inactivation respective impacte la folliculogenèse, il est plausible que SFRP4 et YAP1 régulent l’action de la FSH en déstabilisant la CTNNB1 dans les cellules de la granulosa. Ainsi, les objectifs de ce projet sont 1) d’élucider le mécanisme d’action de SFRP4 dans les cellules de la granulosa ovarienne, par la détermination des protéines de signalisation impliquées et de ses gènes cibles, et 2) déterminer le rôle de YAP1 dans la régulation de la voie WNT/CTNNB1 dans les cellules de la granulosa. En débutant par le volet SFRP4, ses gènes cibles et son mécanisme d’action dans l’ovaire ont été étudiés à l’aide de cultures primaires de cellules de la granulosa (CGs), provenant de follicules préovulatoires de souris type sauvage stimulées à l’eCG (equine chorionic gonadotropin). Les CGs ont été traitées avec du SFRP4 exogène, FSH recombinante ou combinaison des deux (avec SFRP4 comme prétraitement à la FSH). Le traitement de SFRP4 a notamment inhibé l’augmentation des niveaux d'ARNm des gènes cibles de la FSH. Ensuite, l’étude de cascades de signalisation intracellulaires, à l’aide de l’immunobuvardage, a permis d’établir que SFRP4 n’effectue pas son action antagoniste de l’action de la FSH via la CTNNB1, mais plutôt via l’axe GSK3β (glycogen synthase kinase 3 beta)/AMPK (5' AMP-activated protein kinase)/AKT (thymoma viral proto-oncogene 1 ou protéine kinase B)/ FOXO1 (Forkhead box protein O1). Par ailleurs, l’inactivation de mTOR (mammalian target of rapamycin), un autre effecteur en aval d’AKT, a également entraîné une augmentation de l’activité autophagique, contribuant potentiellement à l’apoptose observée en traitant les GCs avec SFRP4. Ces résultats in vitro ont été validés chez le modèle transgénique Sfrp4 inactivé. Concernant le second objectif, un autre modèle transgénique, nommé Rosa26Yap5SA, a été utilisé pour étudier le rôle de YAP1 dans l’ovaire. Ce modèle exprime un gène codant pour une protéine YAP1 non phosphorylable par LATS (Large Tumor Suppressor), appelée YAP5SA, la rendant active de façon constitutive. Malheureusement, malgré l’emploi de plusieurs modèles cre pour cibler une recombinaison dans les CGs des follicules antraux, la détection de YAP5SA était seulement restreinte aux cellules lutéales, rendant impossible la validation de notre objectif initial. Ce modèle a tout de même permis d’apprécier que l’augmentation de l’activité intranucléaire de YAP1 dans les cellules lutéales mène à leur transdifférenciation en myofibroblastes-like, et possiblement en cellules de Sertoli-like. En ayant employé le modèle Amhr2cre, il a aussi été possible d’étudier l’impact d’une augmentation de l’activité de YAP1 dans le développement du système reproducteur en ciblant le mésenchyme des canaux de Müller, ainsi que le stroma endométrial et le myomètre utérins. L’expression de YAP5SA dans ces tissus a mené à une transdifférenciation cellulaire en myofibroblastes-like, définissant un rôle majeur de YAP1 dans le développement du même phénotype précédemment observé chez le modèle Lats1 flox/flox; Lats2flox/flox; Amhr2cre/+. Gonadotropins, specifically follicle-stimulating hormone (FSH) and luteinizing hormone (LH), play a central role in regulating ovarian follicular growth. While their roles within the ovary are well established, their signaling mechanisms remain only partially understood. It is clear, however, that gonadotropins regulate the expression and function of various intraovarian factors, including the secreted glycoproteins of the WNT family. These WNTs, in turn, act in an autocrine/paracrine manner to modulate and coordinate the cellular response to gonadotropins, thus serving as essential regulators of ovarian function and female fertility. Most of their actions are thought to be mediated through the WNT/β-catenin pathway (the canonical pathway) by targeting β-catenin (CTNNB1), a co-activator protein involved in the expression of FSH target genes. Some negative regulators of fertility may also act via the canonical WNT pathway. Among these regulators, SFRP4, a protein present particularly in the granulosa cells of antral follicles and in luteal cells, typically acts as an antagonist of the WNT/CTNNB1 pathway in various cell types, though this has never been validated in the ovary. Moreover, some studies suggest that the degradation of CTNNB1 requires the involvement of YAP1 (an intracellular effector of the Hippo signaling pathway) in its phosphorylated form. Given that SFRP4 and YAP1 are expressed in granulosa cells and that their respective inactivation affects folliculogenesis, it is plausible that SFRP4 and YAP1 regulate FSH action by destabilizing CTNNB1 in granulosa cells. Therefore, the objectives of this project are: 1) to elucidate the mechanism of action of SFRP4 in ovarian granulosa cells by identifying the signaling proteins involved and its target genes, and 2) to determine the role of YAP1 in regulating the WNT/CTNNB1 pathway in granulosa cells. Starting with SFRP4, its target genes and mechanism of action in the ovary were studied using primary cultures of granulosa cells (GCs) isolated from preovulatory follicles of wild-type mice stimulated with eCG. GCs were pretreated with exogenous SFRP4 or recombinant FSH alone, or in combination. This SFRP4 treatment inhibited the increase in mRNA levels of FSH target genes. The study of intracellular signaling cascade activity (by immunoblotting) established that SFRP4 does not antagonize FSH action via CTNNB1 but rather acts on the GSK3β/AMPK/AKT/FOXO1 axis. The loss of mTOR activity also resulted in the activation of autophagy. These in vitro results were validated using a transgenic Sfrp4 knock-out model. For the second objective, another transgenic model, named Rosa26Yap5SA, was used to study the role of YAP1 in the ovary. This model expresses a gene encoding a non-phosphorylatable YAP1 protein (called YAP5SA) that is constitutively active. Unfortunately, despite using several Cre models to target recombination in GCs of antral follicles, YAP5SA expression was restricted to luteal cells, making it impossible to attain the initial objective. However, this model revealed that increased nuclear activity of YAP1 in luteal cells leads to their transdifferentiation into myofibroblast-like cells and possibly Sertoli-like cells. Using the Amhr2cre model, it was also possible to study the impact of increased YAP1 activity in reproductive system development by targeting the mesenchyme of of the Müllerian ducts, as well as the endometrial stroma and uterine myometrium. The expression of YAP5SA in these tissues led to cellular transdifferentiation into myofibroblast-like cells, highlighting a major role for YAP1 in developing a phenotype previously observed in the Lats1flox/flox; Lats2flox/flox; Amhr2cre/+ model.