Effects of LPS exposure on the accumulation of reactive oxygen species in cerebral pericytes

Abstract

Les péricytes cérébraux sont un type de cellule de l'unité neurovasculaire (UNV) qui tapissent les capillaires cérébraux et exercent de multiples fonctions, notamment l'angiogenèse, la régulation du flux sanguin, le maintien de la barrière hémato-encéphalique (BHE) et les fonctions immunitaires. Le dysfonctionnement des péricytes a été suggéré comme contribuant aux maladies neurodégénératives dont la physiopathologie implique à la fois l’inflammation neuronal et les ROS. Il convient de noter que les péricytes expriment le récepteur Toll-like (TLR-4), qui peut détecter les lipopolysaccharides (LPS) des bactéries à Gram négatif, et il a été démontré que les injections systémiques de LPS provoquent des changements rapides dans la sécrétion de chimiokines par les péricytes. Cependant, on ignore si les composés inflammatoires, tel que le LPS, peuvent eux-mêmes provoquer une élévation des ROS dans les péricytes. Ici, nous testons l'hypothèse selon laquelle l'application de LPS augmente les niveaux de ROS dans les péricytes corticaux et tentons d'étudier certains des mécanismes impliqués. Dans ce projet, nous décrivons d’abord une méthode pour mesurer les niveaux d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) dans les péricytes de tranches de cerveau corticales aiguës de souris. Deuxièmement, nous testons si l'exposition au LPS augmente les niveaux de ROS dans les péricytes cérébraux et, troisièmement, nous analysons la distribution mitochondriale dans le soma des péricytes à travers l'arbre vasculaire du cortex visuel primaire à l'aide d'une base de données publique de microscopie électronique (MICrONS). En utilisant un indicateur de superoxyde, le dihydroxyéthidium (DHE), comme rapporteur des ROS, nous établissons des paramètres pour mesurer les ROS dans des tranches de cerveau aiguës. Nous constatons que le traitement des tranches avec du LPS a provoqué une augmentation significative des ROS des péricytes. L'inhibition pharmacologique du récepteur TLR-4 avec TAK-242 suggère que l'augmentation des ROS induite par le LPS était indépendante de l'activation de la voie du récepteur TLR-4. Nous avons également utilisé des inhibiteurs pharmacologiques des enzymes NADPH oxydase pour examiner le rôle potentiel des NOX dans les élévations des ROS des péricytes induites par les LPS. L'inhibition de NOX4 avec Setanaxib (GKT137831) n'a pas empêché l'élévation des ROS induite par le LPS, alors que les résultats du blocage de NOX2 avec Ebselen n'étaient pas concluants. Enfin, une analyse de la densité mitochondriale dans les cellules musculaires lisses et les somas péricytaires a révélé des différences de densité mitochondriale péricytaire selon le sous-type et la profondeur corticale. Ces résultats établissent une méthode de quantification des ROS péricytaires dans des tranches cérébrales aiguës et révèlent que le LPS provoque une augmentation des ROS péricytaires soit directement, soit par production à partir d'un autre type de cellule via un mécanisme encore non identifié. D'autres travaux visant à élucider le mécanisme exact par lequel le LPS augmente les ROS pourraient faire la lumière sur les liens entre l'inflammation et le dysfonctionnement des péricytes dans les maladies du système nerveux. Cerebral pericytes are a cell type of the Neurovascular Unit (NVU) that lines brain capillaries and exerts multiple functions, including angiogenesis, regulation of blood flow, maintenance of the blood-brain barrier (BBB), and immune functions. Pericyte dysfunction has been suggested as a contributor to neurodegenerative diseases whose pathophysiology involves both neuroinflammation and ROS. Of note, pericytes express the toll-like receptor (TLR)-4, which can detect lipopolysaccharides (LPS) of gram-negative bacteria, and systemic injections of LPS have been shown to cause rapid changes in chemokine secretion from pericytes. However, whether inflammatory compounds, such as LPS, can themselves cause ROS elevations in pericytes remains unknown. Here, we test the hypothesis that LPS application increases ROS levels within cortical pericytes and attempt to study some of the mechanisms involved. In this project, we first outline a method to measure the reactive oxygen species (ROS) levels in pericytes of acute cortical mouse brain slices. Secondly, we test whether LPS exposure increases the levels of ROS in cerebral pericytes, and third, we analyze the mitochondrial distribution in the soma of pericytes across the vascular tree in the primary visual cortex using a public electron microscopy database (MICrONS). Using a superoxide indicator, dihydroxyethidium (DHE) as a reporter for ROS, we establish parameters for measuring ROS in acute brain slices. We find that treating the slices with LPS caused a significant increase in the pericyte ROS. Pharmacological inhibition of the TLR-4 receptor with TAK-242 suggests that the LPS-induced increase in ROS was independent of TLR-4 receptor pathway activation. We also used pharmacological inhibitors of NADPH oxidase enzymes to examine the potential role of NOX in LPS-induced pericyte ROS elevations. NOX4 inhibition with Setanaxib (GKT137831) did not prevent the LPS-induced ROS elevation, whereas the results of blocking NOX2 with Ebselen were inconclusive. Finally, an analysis of mitochondrial density in smooth muscle cells and pericyte somas revealed differences in pericyte mitochondrial density according to subtype and cortical depth. These results establish a method for quantification of pericyte ROS in acute brain slices and reveal that LPS causes an increase in pericyte ROS either directly or by means of production from another cell type via a yet unidentified mechanism. Further work aiming at elucidating the exact mechanism by which LPS increases ROS may shed light on the links between inflammation and pericyte dysfunction in diseases of the nervous system.