D'in vitro à in vivo : développement de biocapteurs plasmoniques pour la détection des protéines et d'anticorps

Abstract

Les méthodes conventionnelles de détection des biomolécules dans les échantillons cliniques, telles que le dosage immuno-enzymatique (ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay), présentent plusieurs limitations, notamment un temps d'analyse relativement long pouvant atteindre 24 heures, une sensibilité parfois insuffisante, ainsi qu’une incapacité à fournir des informations spatiotemporelles sur les processus biologiques. Le développement de nouvelles technologies analytiques, offrant une sensibilité accrue, une spécificité améliorée et une réponse rapide, est essentiel pour la quantification précise de biomolécules clés, telles que les protéines et les anticorps, dans les biofluides et potentiellement au sein des tissus. Les biocapteurs plasmoniques constituent une technologie de pointe pour la détection ultrasensible et hautement spécifique des biomolécules, en exploitant l'interaction entre la lumière et les électrons libres dans les nanostructures métalliques, ce qui entraîne une amplification des réponses optiques. Parmi eux, les biocapteurs basés sur la résonance des plasmons de surface (SPR) permettent une détection sans marquage et en temps réel des interactions biomoléculaires en surveillant les variations de l’indice de réfraction à l'interface métal-diélectrique, généralement un film mince d’or, lors de la liaison des biomolécules. Par ailleurs, la diffusion Raman exaltée par les surfaces (SERS) constitue une autre approche plasmonique particulièrement sensible, offrant une empreinte spectroscopique unique des molécules en amplifiant le signal de diffusion Raman à proximité de nanostructures métalliques. Cette thèse est divisée en trois volets principaux, centrés sur le développement de biocapteurs plasmoniques pour la détection in vitro, ex vivo et in vivo des anticorps et des protéines. Tout d’abord, des capteurs SPR ont été développés pendant la pandémie de COVID-19 afin de détecter les anticorps contre la protéine de la nucléocapside, la protéine de spicule et son domaine de liaison au récepteur, dans divers fluides biologiques, notamment le plasma, le sérum et les gouttes de sang séché prélevées des individus testés positifs par amplification en chaîne par polymérase. La sensibilité et la spécificité de ces capteurs ont été évaluées par comparaison avec un groupe contrôle et validées par rapport aux tests ELISA. Par ailleurs, des essais de pseudo-neutralisation ont été développés in vitro pour évaluer la maturation et le taux d’anticorps neutralisants générés en réponse à l’infection par le SRAS-CoV-2 ou à la vaccination, en utilisant la protéine de spicule native ainsi que certaines de ses variantes préoccupantes. Deuxièmement, un biocapteur basé sur la technique SERS avec une invasion minimale et une résolution spatiale élevée a été développé en tant que nanoendoscope pour la détection quantitative de S100β, une protéine astrocytaire, dont la concentration plasmatique est associée à diverses maladies neurodégénératives. Des fibres optiques effilées avec un diamètre de la pointe de 700 nm ont été fonctionnalisées avec un réseau dense et homogène de nanoparticules d’or sphériques modifiées avec un anticorps primaire anti-S100β pour la détection de la protéine S100β, avec une résolution micrométrique, dans différentes régions de tranches de cerveau de souris soumises à différentes stimulations physiologiques. La quantification ex vivo a été réalisée à l’aide de nanotags SERS fonctionnalisés avec l’anticorps secondaire. Troisièmement, des endoscopes SERS ont été optimisés en utilisant des fibres optiques de 70 μm de diamètre pour la détection in vivo de la protéine S100β dans le cerveau de modèles murins soumis à des stimulations optogénétique et tactile. La concentration de S100β a été quantifiée dans le noyau sensoriel principal du trijumeau, situé dans le tronc cérébral, lors de mouvements rythmiques de la mâchoire induits par une stimulation optogénétique de l’aire corticale masticatoire chez des souris éveillées. Ces mesures ont été comparées aux niveaux basaux de S100β ainsi qu’à une condition contrôle impliquant une stimulation du cortex visuel. Par ailleurs, la libération de S100β dans le cortex somatosensoriel primaire a été évaluée en réponse à une stimulation tactile de la patte arrière des souris et comparée aux niveaux basaux. Dans leur ensemble, les résultats de cette thèse soulignent le potentiel des biocapteurs plasmoniques basés sur SPR et SERS pour une détection ultrasensible et hautement spécifique des biomolécules dans des matrices biologiques complexes. Ces technologies innovantes ouvrent de nouvelles perspectives pour l’étude approfondie des biomarqueurs, tout en offrant un fort potentiel pour des applications cliniques. Conventional methods for the detection of biomolecules in clinical samples, such as the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), exhibit several limitations, including a relatively long analysis time (up to 24 hours), limited sensitivity, and an inability to provide spatiotemporal information on biological processes. The development of advanced analytical technologies with high sensitivity and rapid response capabilities is necessary for the assessment of important biomolecules such as proteins and antibodies in biofluids, and ultimately, within tissues. Plasmonic-based biosensors have emerged as a powerful tool for highly sensitive and specific detection of biomolecules by exploiting the interaction of light with free electrons in metallic nanostructures, which amplifies optical responses. Among them, surface plasmon resonance (SPR)-based biosensors enable label-free and real-time detection of molecular interactions by measuring the changes in refractive index at the metal-dielectric interface, typically a thin gold film, upon biomolecular binding. Furthermore, surface-enhanced Raman scattering (SERS) represents another highly sensitive plasmonic-based technique that provides the unique molecular fingerprint of molecules by amplifying Raman scattering signal near nanostructured metallic surfaces. This thesis is structured into three main parts, focusing on the development of plasmonic biosensors for in vitro, ex vivo and in vivo antibody and protein detection. First, SPR sensors were developed during the pandemic outbreak of coronavirus disease 2019 (COVID-19) to detect antibodies expressed against the nucleocapsid protein, spike protein, and its receptor binding domain in plasma, serum, and dried blood spots collected from polymerase chain reaction-positive individuals. The results were compared to a control group to validate the sensitivity and specificity of the sensors compared to the ELISA assays. Additionally, an in vitro surrogate neutralization assay was developed to assess the maturity and the level of neutralizing antibodies produced by the immune system of individuals infected with COVID-19 or vaccinated against it using the native and some variants of concern of the spike protein. Secondly, a surface-enhanced Raman scattering (SERS) biosensor with minimal invasiveness and high spatial resolution was developed as a nanoendoscope for the quantitative detection of S100β, an astrocytic protein, whose plasmatic concentration has been associated with different neurodegenerative diseases. Pulled optical fibers with a tip diameter of 700 nm were decorated with dense and well-dispersed arrays of spherical gold nanoparticles modified with anti-S100β primary antibody to detect S100β protein in different regions of mouse brain slices under different physiological stimuli with micrometer resolution. Ex vivo quantification was achieved using SERS-active nanotags functionalized with secondary antibodies. Finally, SERS endoscopes were adapted using 70 μm optical fibers to enable in vivo detection of S100β protein in the brain of mouse models during the optogenetic and tactile stimulation. The concentration of S100β protein was quantified in the main trigeminal sensory nucleus, located in the brainstem, during rhythmic jaw movements induced by optogenetic stimulation of the cortical masticatory area of awake mice. These measurements were compared to basal protein levels and a control condition involving stimulation of the visual cortex. Additionally, the release of S100β protein in the primary somatosensory cortex following tactile stimulation of the hindpaw was assessed and compared to basal levels. Taken together, the results presented in this thesis demonstrate the ability of SPR and SERS-based plasmonic biosensors for highly sensitive and specific detection of biomolecules in complex biological matrices. These novel technologies create new opportunities to advance biomarker research and hold significant potential for clinical applications.