Identification de facteurs adaptatifs de survie environnementale en présence de doses sous-létales de peptides antimicrobiens chez Vibrio cholerae

Abstract

Les polymyxines sont des peptides antimicrobiens (PAM) utilisés pour la prévention d’infections bactériennes à la ferme et en aquaculture, ainsi qu’en dernier recours contre les infections multirésistantes aux antibiotiques conventionnels chez l’humain. Peu absorbées, elles peuvent contaminer les environnements aquatiques par ruissellement. Vibrio cholerae est une bactérie à Gram négatif retrouvée dans l’eau et causant le choléra. Nous posons l’hypothèse que la pollution des milieux par les PAM pourrait modifier les interactions microbiennes d’une communauté et la survie de bactéries pathogènes. L’objectif est de déterminer les effets de concentrations sous-inhibitrices de polymyxine B (PmB) sur les facteurs adaptatifs de survie environnementale de V. cholerae, et de déterminer leurs rôles dans la persistance bactérienne. Des approches de génomique, transcriptomique et protéomique ont été utilisées. Une évolution expérimentale en présence de doses sous-inhibitrices de PmB a mené à l’identification de variants hyper-vésiculateurs sécrétant des vésicules membranaires de grande taille. En titrant la PmB, les vésicules limitent son impact sur l’enveloppe et la motilité de V. cholerae. Une analyse de protéomique globale chez V. cholerae a permis d’identifier les protéines modulées par la présence de concentrations sous-inhibitrices de PmB. Plus de 60 % et 28 % des protéines du sécrétome et du protéome cellulaire non-sécrété avaient une abondance relative modifiée, respectivement. Parmi celles-ci, Hcp, une composante majeure du système de sécrétion de type VI (SST6) a été identifiée. Mes résultats ont démontré que la PmB augmente l’expression et la sécrétion de Hcp par le SST6, via le système à deux composantes VxrAB. L’activité accrue du SST6 mène à une compétition inter-bactérienne plus efficace et à une meilleure résistance à la prédation, tel que démontré par des tests de compétition sur milieu solide avec Escherichia coli et de cytotoxicité envers Dictyostelium discoideum. De plus, une analyse du transcriptome a permis d’identifier un nouvel acteur de la résistance aux PAM, la protéine de membrane externe OmpV, dont l’expression est augmentée par la PmB. En étudiant le contexte génomique de OmpV, j’ai identifié l’opéron ompV-virK-carRS spécialisé dans la résistance aux PAM chez V. cholerae, dont les produits des gènes permettent de détecter et d’activer plusieurs mécanismes de résistance. Des analyses structurelles de OmpV et d’amarrage avec la PmB suggèrent que cette protéine pourrait agir comme senseur, induire une signalisation intracellulaire et activer la transcription d’une pompe à efflux en réponse à la PmB. Collectivement, mes résultats révèlent la complexité de la résistance aux PAM, qui peuvent, à l'inverse du rôle antimicrobien qui leur est décerné, favoriser la survie de bactéries pathogènes en activant des mécanismes de résistance et de compétition microbienne. Ces résultats soulignent donc l’impact potentiel de la pollution aquatique par les PAM sur la survie des pathogènes et les interactions microbiennes. Ils renforcent également l'importance d'une utilisation judicieuse des PAM comme alternatives aux antibiotiques et pourraient aiguiller l'industrie pharmaceutique dans le design de PAM moins favorables au développement de résistance. Polymyxins are antimicrobial peptides (AMPs) used for prevention of bacterial infections on farms and in aquaculture, and as last resort treatment against antibiotic resistant bacterial infections in human health. Poorly absorbed, polymyxins can contaminate aquatic environments by runoff. Vibrio cholerae is a Gram-negative bacterium found in water and causing cholera. We hypothesized that water pollution by AMPs could modify microbial interactions in a community and the survival of pathogenic bacteria. The objective was to determine the effects of sub-inhibitory concentrations of polymyxin B (PmB) on environmental survival factors in V. cholerae and to determine their roles in bacterial survival. Genomic, transcriptomic and proteomic approaches were used. An experimental evolution in the presence of sub-inhibitory concentrations of PmB led to the identification of hypervesiculating variants, secreting large membrane vesicles. By titrating PmB, the large membrane vesicles allow V. cholerae to limit its impact on bacterial envelope and motility. Global proteomic analysis of V. cholerae grown in the presence of sub-inhibitory concentrations of PmB showed that 60 % and 28 % of the proteins of the secretome and the proteome had a modified abundance, respectively. Amongst them, Hcp, a major component of the type VI secretion system (T6SS) was identified. My results showed that PmB increases the expression and the secretion of Hcp by the T6SS in a VxrAB dependent manner. The increased activity of the T6SS in the presence of sub-inhibitory concentrations of PmB led to a more efficient bacterial competition and resistance to grazing by amoebas Dictyostelium discoideum. Furthermore, a transcriptomic analysis identified a new actor of AMP resistance in V. cholerae, the outer membrane protein OmpV. The expression of ompV is increased by the presence of PmB. By studying its genomic context, I identified the ompV-virK-carRS operon, specialized in AMP resistance in V. cholerae. This operon gene products lead to AMP detection and activation of multiple resistance factors. A structural analysis of OmpV and a docking simulations analysis with PmB suggest that it can act as a sensor, induce intracellular signalisation and the expression of an efflux pump in response to PmB. Collectively, my results reveal the complexity of AMP resistance; AMPs, conversely to the antimicrobial activity they are associated with, can in fact promote pathogenic bacteria’s survival by activating AMP tolerance and resistance mechanisms, and microbial competition mechanisms. These results emphasize the potential impacts of aquatic AMP pollution on microbial interactions and survival of pathogenic bacteria. They also point out the importance of a judicious use of AMPs as antibiotic alternative and could help the design of AMPs that are less susceptible to antimicrobial resistance development.