Modular dual-labeled oligonucleotides for biosensing applications

Abstract

Depuis l'invention de la synthèse d'ADN sur support solide, la capacité de synthétiser rapidement de l'ADN et d'incorporer des fonctionnalités non naturelles dans les brins d'ADN a considérablement fait progresser la chimie moderne. Grâce aux caractéristiques structurelles et à la programmabilité de l'ADN, la nanotechnologie de l'ADN s'est développée rapidement depuis la première conception d'un cube d'ADN en 1980. La capacité de construire diverses nanostructures d'ADN auto-assemblées a trouvé de nombreuses applications dans l'imagerie cellulaire, l'administration de médicaments et les biocapteurs. En particulier, les biocapteurs électrochimiques suscitent un grand intérêt en raison de leur potentiel de commercialisation pour répondre à la demande croissante pour des tests au chevet du patient. Cependant, l'une des limites de ces capteurs électrochimiques est qu'ils nécessitent généralement des stratégies de double marquage des brin d'ADN, qui sont souvent limitées par les phosphoramidites et les supports solides modifiés disponibles commercialement. Cette thèse aborde ces limitations en développant une approche simple et modulaire pour le double marquage de l'ADN. Comme premier objectif de cette thèse, nous avons utilisé des stratégies conventionnelles de double marquage pour étudier l'universalité et le mécanisme de fonctionnement d'une nouvelle plateforme de détection à base d'ADN. En utilisant deux éléments de reconnaissance et une molécule rapportrice de bleu de méthylène, nous avons démontré l'universalité de ce mécanisme de détection. Nous avons également caractérisé un nouveau mécanisme de signalisation qui utilise un phénomène d’inhibition rédox par contact attribuable à une interaction non covalente entre nos cibles protéiques (streptavidine, anticorps ADN) et notre rapporteur rédox, le bleu de méthylène. Cependant, un autre résultat clé de ce chapitre est que les stratégies conventionnelles d'ADN doublement marqué manquent généralement d'efficacité et d'universalité. Motivés par la nécessité de développer des stratégies de double marquage plus efficaces pour l'ADN, nous avons ensuite développé et validé une stratégie modulaire de modification de l'ADN en incorporant une double poignée qui utilise une amine et un groupement DBCO (dibenzocyclooctyne). Nous avons demontré que cette nouvelle approche permettait l'incorporation précise d'une large gamme d'étiquettes moléculaires comme des motifs de bioreconnaissance à la poignée DBCO (p. ex., peptides, petites molécules) et divers éléments rédox ou de fluorophores à la poignée amine. Par la suite, nous démontrons que cette nouvelle stratégie chimique a conduit à la mise au point d'un prototype de test de dépistage du cannabis sur le bord de la route, qui est actuellement testé en vue d'une commercialisation future par une société montréalaise appelée Anasens. En utilisant la même stratégie d'étiquetage, des capteurs pour la cocaïne, l'amphétamine, la métamphétamine, l'héroïne et le NT-pro-BNP sont également en cours de développement et devraient être commercialisés dans un avenir proche. Cela démontre une fois de plus l'importance de cet outil chimique et son impact sur l'application des biocapteurs. Nous pensons que la stratégie chimique proposée pourrait également faciliter considérablement le développement de nombreuses autres applications dans le domaine des nanotechnologies d'ADN. Since the invention of solid-support DNA synthesis, the ability to rapidly synthesize DNA and incorporate non-natural functionalities into DNA strands has significantly advanced modern chemistry. Thanks to DNA’s structural features and programmability, DNA nanotechnology has developed rapidly since the first DNA cube design in 1980. The ability to construct various self- assembled DNA nanostructures has found numerous applications in cellular imaging, drug delivery, and DNA biosensors. In particular, electrochemical biosensors have gained significant interest due to their potential for commercialisation by addressing a growing demand for point- of-care diagnostic tests. However, one limitation of these electrochemical sensors is that they typically require dual labelling strategies of their DNA strand, which are often limited by commercially available phosphoramidites and modified solid support. This thesis addresses these limitations by developing a simple and modular approach to dual-label DNA. As a first objective to this thesis, we employed conventional dual labelling strategies to investigate the universality and working mechanism of a novel DNA-based sensing platform. By employing two recognition elements and one methylene blue reporter molecule, we demonstrated this sensing mechanism's universality. We also characterized a novel signalling mechanism that employs a contact-redox-inhibition mechanism attributable to a non-covalent interaction between our protein targets (streptavidin, DNA antibodies) and our redox reporter methylene blue. However, another key finding of was that conventional dual-labelled DNA strategies typically lack efficiency and universality. Motivated by the need to develop more efficient dual labelling strategies for DNA, we then developed and validated in a modular dual-handled DNA modification strategy that employs amine and DBCO (dibenzocyclooctyne) handles. We showed that this novel approach enabled the precise incorporation of a wide range of labels, allowing for the attachment of biorecognition moieties to the DBCO handle (e.g., peptides, small molecules) and various redox and fluorophore moieties to the amine handle. We show that this new chemical strategy led to the development of a cannabis roadside testing prototype, which is now being tested for future commercialization by a Montreal based company called Anasens. Using the same labelling strategy, sensors for cocaine, amphetamine, metamphetamin, heroin, NT-pro-BNP are also under development aiming for commercialization in the near future. This further demonstrates the importance of this chemical tool and its impact on biosensor application. We believe this proposed chemical strategy could also significantly facilitate the development of multiple other applications in DNA nanotechnology.