Identification d’une nouvelle complexité de l’identité et la fonction des myocytes au cours de la myogenèse embryonnaire chez les vertébrés

Abstract

Lors de la myogenèse, les cellules progénitrices musculaires s'engagent dans la lignée des myoblastes, se différencient en myocytes, puis fusionnent pour former des fibres musculaires multinucléées. Pourtant, les mécanismes initiaux de ce processus, notament durant l’embryogenèse, demeurent mal compris. Sur le plan moléculaire, des études récentes ont identifié deux fusogènes spécifiques aux vertébrés, Myomaker et Myomixer, comme étant essentiels à la fusion. Leur activité repose toutefois sur la dynamique du cytosquelette d’actine. Bien que les régulateurs de l’actine Dock1/Elmo/Rac1 soient essentiels à la fusion des myoblastes, les voies de signalisation contrôlant la GTPase Rac1 dans ce context restent largement méconnues. Dans cette thèse, nous avons cherché à répondre à deux questions fondamentales : 1) Quels mécanismes initient la formation du muscle ? 2) Quels interacteurs en amont régulent Rac1 lors de la fusion des myoblastes ? Dans le chapitre 2, nous avons réalisé une analyse transcriptionelle à l’échelle unicellulaire sur des somites de souris, permettant d’identifier deux états distincts de myocytes, Mc1 et Mc2. Les Mc1 expriment à la fois Myomaker et Myomixer, tandis que les Mc2 n’expriment que Myomaker. L’hybridation in situ fluorescente et l’immunofluorescence ont révélé la présence simultanée des deux populations dans les mêmes somites. Le traçage de lignée, effectué à l’aide de la souris Myomixer-T2A-Cre a démontré que Mc2 dérive de Mc1. Sur le plan moléculaire, le rôle des facteurs de transcription Mef2a et Rxrg dans la régulation de la transcription de Myomixer, et donc de la transition Mc1-Mc2, a été mis en évidence. L’inhibition de l’expression de Mef2a entraîne une diminution de la transcription de Myomixer. Nous avons également démontré une interaction entre Rxrg et les facteurs myogéniques MyoD ou MyoG, modulant leur activité transcriptionnelle au promoteur de Myomixer dans des essais de luciférase. Ces résultats révèlent une diversité fonctionelle des myocytes au cours du développement musculaire chez la souris, remettant en question la vision traditionelle de l’homogénéité des précurseurs musculaires chez les vertébrés. Dans le chapitre 3, nous avons analysé l’interactome de Rac1 pendant la myogenèse à l’aide d’un marquage dépendant de la proximité et nous avons démontré ses changements dynamiques au cours de la prolifération et de la différenciation des myoblastes. Nous avons identifié de nouveaux interacteurs, Piezo1 et Pacsin2, impliqués dans la réponse aux stimuli mécaniques et dans l’assemblage des lipides rafts, respectivement. De plus, nous avons observé une translocation différenciation-dépendante de Pacsin2, passant des vésicules cytoplasmiques à la membrane plasmique, suggérant un rôle potentiel dans la fusion des myoblastes. Nos découvertes apportent de nouvelles perspectives sur les mécanismes moléculaires sous-jacents à la fusion et mettent en évidence des candidats prometteurs pour des investigations futures. Cette étude met en évidence un niveau de complexité auparavant méconnu dans l’identité et la fonction des myocytes au cours du développement musculaire embryonnaire et identifie de nouveaux candidats prometteurs pour la fusion des myoblastes. During myogenesis, muscle progenitor cells commit to the myoblast lineage, differentiate into myocytes, and subsequently fuse to form multinucleated muscle fibers. Yet, the early mechanisms that initiate this process, particularly during embryogenesis, remain poorly understood. At the molecular level, recent studies have identified two vertebrate-specific fusogens, Myomaker and Myomixer, as essential for fusion. Their activity, however, depends on the dynamics of the actin cytoskeleton. While the actin regulators Dock1/Elmo/Rac1 are crucial for myoblast fusion, the fusion-specific signaling pathways regulating the GTPase Rac1 remain largely unkown. In this thesis, we aimed to address two fundamental questions: 1) What mechanisms initiate muscle formation? 2) What upstream interactors regulate Rac1 during myoblast fusion? In chapter two, we performed single-cell transcriptomic analysis on mouse somites, which led to the identification of two distict myocyte states, Mc1 and Mc2. Mc1 expresses both Myomaker and Myomixer, while Mc2 expresses only Myomaker. Fluorescent in situ hybridization and immunofluorescence revealed the simultaneous presence of both populations within the same somites. Lineage tracing using the Myomixer-T2A-Cre mouse demonstrated that Mc2 derives from Mc1. A the molecular level, we highlight the role of the transcription factors Mef2a and Rxrg in the transcriptional regulation of Myomixer. The knock down of Mef2a results in a decrease in Myomixer transcription. We also found Rxrg to interact with the myogenic factors MyoD and MyoG, modulating their transcriptional activity at the Myomixer promoter in luciferase assays. These results uncover a functional diversity among myocytes during muscle development in the mouse challenging the traditional view of vertebrate muscle precursor homogeneity. In chapter three, we analyzed the Rac1 interactome during myogenesis using proximitydependent labeling and demonstrated its dynamic changes across myoblast proliferation and differentiation. We identified new interactors, Piezo1 and Pacsin2, involved in response to mechanical stimulus and lipid raft assembly, respectively. Interestingly, we observed a differentiation-dependent translocation of Pacsin2 from cytoplasmic vesicles to the plasma membrane, suggesting a potential role in myoblast fusion. Our findings provide new insights into the molecular mechanisms underlying myoblast fusion and highlights promising candidates for further investigation. This study underscors a previously unappreciated level of complexity in myocyte identity and function during early muscle development and highlights new promising candidates for myoblast fusion.