Développement d'une librairie de nanoantennes fluorescentes pour l'étude des changements conformationnels des protéines

Abstract

La fonction d’une protéine est directement liée à sa conformation tridimensionnelle, soit l’orientation des structures indépendantes qui la composent dans l’espace. La conformation d’une protéine distingue ses formes actives de celles inactives et dicte ses interactions avec l’environnement. Détecter les changements conformationnels des protéines est alors essentiel pour comprendre leurs fonctions et concevoir des ligands qui en moduleront l’activité : un principe fondamental dans la découverte de médicaments. La conception rationnelle de médicaments est principalement réalisée au site orthostérique de la cible protéique, soit l’endroit où se lient leurs ligands naturels. Au vu de l’homologie entre les sites actifs des protéines d’une même famille et de la concurrence avec les ligands naturels, les médicaments agissant sur le site orthostérique ont souvent une sélectivité et une spécificité réduites, ce qui peut engendrer des réponses physiologiques indésirables. Les modulateurs allostériques, une classe plus récente de médicaments liant la protéine cible à un site distant du substrat, ont démontré leur capacité à moduler l’activité des protéines « undruggable ». Ils restent peu accessibles dû au manque d’information structurelle sur ceux-ci, ce qui illustre la nécessité de sondes pouvant suivre les changements conformationnels. Récemment, le laboratoire du Pr. Vallée-Bélisle a rapporté une nouvelle approche permettant d’étudier les changements conformationnels des protéines (Nat. Methods 2022). Une nanoantenne, soit une séquence d’ADN ou de polyéthylène glycol (PEG) contenant un fluorophore est ancrée à proximité d’une protéine d’intérêt, ce qui permet d’en sonder la surface et ainsi la conformation. L’universalité de cette méthode est toutefois réduite par la stratégie actuelle d'attachement à l'aide d’une plateforme biotine-streptavidine qui peut nuire à la détection des changements conformationnels par encombrement stérique ou simplement les modifier. Pour des applications à haut débit de type « omiques », il devient nécessaire de développer une nouvelle génération de nanoantennes qui pourraient être directement attachées aux protéines. Conjuguer nos nanoantennes plutôt à un groupement d'acide nitrilotriacétique (NTA) permettrait une fixation réversible et directe aux protéines marquées à la polyhistidine (His6-tag), une étiquette largement utilisée pour la purification des protéines recombinantes. Nous avons donc confectionné une librairie de composition variée (p. ex., fluorophore, longueur, flexibilité, etc.) dont la combinaison des signaux pourrait servir comme un « code barre » moléculaire spécifique à un changement conformationnel précis de la protéine. À l’aide du modèle simple de la protéine hFc, soit le fragment cristallisable d’un anticorps humain, nous avons confirmé que les NTA de nos nanoantennes lient avec une haute affinité le His6-tag des protéines. Ensuite, nous avons étudié l’interaction de la protéine A bactérienne avec hFc par un essai de criblage avec notre librairie de soixante-dix-sept nanoantennes. Quatre nanoantennes ont été déterminées les plus sensibles à la liaison de la protéine A sur hFc, encourageant le développement d’essais pour l’identification d’inhibiteurs potentiels de cette interaction responsable de la résistance bactérienne de Staphylococcus aureus. Ce projet est unique puisqu’il ouvre la porte à la découverte de ligands pour des protéines difficiles à cibler avec les méthodes conventionnelles. Ce changement de paradigme est plus que bienvenu dans l’univers pharmaceutique où le grand potentiel des modulateurs allostériques est reconnu depuis longtemps. Nos sondes pourraient aussi servir à l’étude des mauvais repliements des protéines impliquées dans les maladies dites conformationnelles comme l’Alzheimer ou le Parkinson. The function of a protein is directly linked to its three-dimensional conformation, that is the orientation of its independent structures in space. A protein has many conformations that distinguish its active from inactive forms and dictates the way it interacts with the environment. Detecting conformational changes in proteins is therefore essential to understand their functions and design ligands to modulate their activity, a fundamental principle in drug discovery. Rational drug design is mainly carried out at the orthosteric site of the protein target where the natural ligand binds. Given the homology between the active sites of proteins in the same family and the competition with natural ligands, drugs acting on the orthosteric site often have reduced selectivity and specificity, which can lead to undesirable physiological responses. Allosteric modulators, a new class of drugs which bind the target protein at a site distant from the substrate, have demonstrated their ability to affect the activity of "undruggable" proteins. However, they remain poorly accessible due to the lack of structural information on them, which illustrates the need for probes that can track conformational changes. Recently, Prof. Vallée-Bélisle's laboratory reported on a new approach to study conformational changes in proteins (Nat. Methods 2022). A nanoantenna, i.e. a DNA or polyethylene glycol (PEG) sequence containing a fluorophore, is anchored in the vicinity of a protein of interest, making it possible to probe its surface and thus its conformation. The universality of this method is, however, reduced by the current strategy of attachment using the biotin-streptavidin plateform which can alter the detection of conformational changes due to steric hindrance. For high-throughput "omics" applications, we need to develop a new generation of nanoantennas that can be directly attached to proteins. Conjugating our nanoantennas to a nitrilotriacetic acid (NTA) moiety would enable reversible, direct attachment to polyhistidine-tagged proteins (His6-tag). The His6-tag is widely used for the purification of recombinant proteins. Thus, we have built a library of varied composition (e.g. fluorophore, length, flexibility, etc.) whose combined signals could serve as a molecular "barcode" specific to a precise conformational change in the protein. Using the simple model of the hFc protein, the cristallizable fragment of a human antibody, we have confirmed that the NTAs in our nanoantennas bind the His6-tag of the proteins with high affinity. Then, we studied the interaction of protein A with hFc in a screening assay using our library of seventy-seven nanoantennas. Four nanoantennas were determined to be the most sensitive to protein A binding to hFc, encouraging the development of assays for the identification of potential inhibitors of this interaction responsible for bacterial resistance in Staphylococcus aureus. This unique project opens the door to the discovery of ligands for proteins that are difficult to target with conventional methods. This paradigm shift is more than welcome in pharmaceutical research, where the great potential of allosteric modulators has long been recognized. Our probes could also be used to analyze the misfolding of proteins involved in so-called conformational diseases such as Alzheimer's or Parkinson's.