Vésicules extracellulaires chez Clostridium perfringens comme stratégie vaccinale pour la protection des poulets de chair contre l’entérite nécrotique

Abstract

L'entérite nécrotique chez les poulets de chair, causée par la bactérie Clostridium perfringens, se caractérise par une mortalité et une nécrose sévère de la muqueuse intestinale. Cette maladie, généralement contrôlée par des additifs alimentaires antimicrobiens, a vu sa prévalence augmenter avec le retrait de plusieurs antibiotiques. Étant donné les stratégies de réduction de l’usage des antimicrobiens, de nouvelles alternatives pouvant contrôler les éclosions doivent être trouvées. Ces dernières années il a été démontré que les bactéries à coloration gram positive peuvent excréter des vésicules extracellulaires (VEs). La lumière de ces vésicules contiendrait des molécules démontrées immunogènes contre les pathogènes dont elles sont issues. À ce jour la compréhension de la composition des VEs de Clostridium perfringens et leurs interactions avec le système immunitaire aviaire est très limitée. Dans ce projet, notre hypothèse était qu’une souche de C. perfringens provenant d’un cas clinique d’entérite nécrotique peut 1) produire des vésicules extracellulaires pouvant contenir des facteurs de virulence et ainsi 2) protéger le poulet contre l’entérite nécrotique lors d’une infection expérimentale. Pour cela, la production et la caractérisation des vésicules extracellulaires ont été faites et leurs effets immunomodulateurs sur les poulets ont été étudiés dans le cadre d’infections expérimentales reproduisant l’entérite nécrotique chez des poulets de chair. À partir d’une culture d’une souche de C. perfringens netB+, des VEs ont été produits sous des conditions de croissance propres aux VEs. Les analyses protéomiques par spectrophotométrie de masses ont identifié 88 protéines présentes dans ces VEs. Sur ce total, 35,22% étaient hébergées dans le cytoplasme. Il a été constaté que la plupart de ces protéines ont des fonctions principalement liées à la traduction et à l’expression des gènes. Par contre la perfringolysine O, la collagénase et une possible entérotoxine, soit des protéines associées à la pathogénicité de C. perfringens, ont aussi été identifiées. Une première inoculation orale de ces VEs chez de poulets de chair a confirmé que les VEs administrées n’avaient pas d’effet négatif sur la croissance et le développement des poulets. Face à un challenge d’entérite nécrotique, les groupes ayant reçu des VEs ont présenté des scores lésionnels macroscopiques et histologiques dans les segments du duodénum et du jéjunum moindres (p< 0.001) que chez les contrôles positifs. De plus, il y a eu une augmentation significative des IgY dans le groupe immunisé avec des VEs et adjuvant (p <0.001). Lors d’un deuxième challenge expérimental, cette fois-ci avec immunisations in ovo puis, par voie orale, une diminution des scores lésionnels dans le duodénum (p < 0.001) et le jéjunum (p < 0.001) a aussi été observée dans les groupes immunisés avec VEs et/ou l’adjuvant comparativement au groupe contrôle positif mais sans effet significatif sur les taux d’anticorps spécifiques à C. perfringens netB+. Dans cette étude, des VEs ont été produites et caractérisées, il a ainsi été possible de déterminer qu’après l’immunisation, les VEs semble avoir conféré une protection locale plutôt qu’une réponse immunitaire sérique. Ces VEs pourraient devenir une alternative intéressante aux antibiotiques, mais davantage d’essais sont nécessaires afin de comprendre leur rôle. Necrotic enteritis in broilers, caused by the bacterium Clostridium perfringens, is characterized by mortality and severe necrosis of the intestinal mucosa. This disease, generally controlled by in-feed antimicrobial additives, has seen its prevalence increase with the withdrawal of several antibiotics. Given strategies to reduce antimicrobial use, new alternatives to control outbreaks need to be found. In recent years, it has been demonstrated that gram-positive bacteria can secrete extracellular vesicles (EVs). The lumen of these vesicles is thought to contain molecules that have been shown to be immunogenic against the pathogens from which they originate. To date, our understanding of the composition of Clostridium perfringens EVs and their interactions with the avian immune system is very limited. In this project, Clostridium perfringens EVs were produced, proteomically characterized and their immunomodulatory effects on chickens were studied in experimental infections mimicking necrotic enteritis in broilers. The selected netB+ C. perfringens strain produced EVs, and proteomic analyses identified 88 proteins. Of these, 35.22% were located in the cytoplasm. Most of these proteins were found to have functions primarily related to translation and gene expression. However, perfringolysin O, collagenase, and a possible enterotoxin - proteins associated with the pathogenicity of C. perfringens- were also identified. A single oral inoculation of broiler chickens with these EVs confirmed that the VEs administered had no negative effect on chicken growth and development. Faced with a challenge of necrotic enteritis, the groups that received EVs showed lower macroscopic and histological lesion scores in the duodenum and jejunum segments (p < 0.001) than the positive controls. In addition, there was a significant increase in IgY in the group immunized with EVs and adjuvant (p <0.001). In a second experimental challenge, this time with in ovo and then oral immunizations, a decrease in lesion scores in the duodenum (p < 0.001) and jejunum (p < 0.001) was also observed in groups immunized with VEs and/or adjuvant compared with the positive control group, but with no significant effect on C. perfringens netB+-specific antibody levels. In this study, EVs were produced and characterized, making it possible to determine that after immunization, EVs conferred local protection rather than a serum immune response. These VEs could become an interesting alternative to antibiotics, but more trials are needed to understand their role.